一种牙髓干细胞大规模常温消化方法技术

一种牙髓干细胞大规模常温消化方法,通过比较几种消化方式对细胞的影响，优化消化方式，在常温条件下实现大规模消化生产，整个消化操作在生物安全柜中进行，减少细胞污染的风险，操作更加连贯；节省了耗材和培养基用量，降低成本；且无需占用培养箱和显微镜；无需离心，提高了细胞的增殖活力；提升了单次处理瓶数；缩短了细胞消化操作时间；提高了牙髓干细胞消化工艺的生产效率。化工艺的生产效率。化工艺的生产效率。

【技术实现步骤摘要】
一种牙髓干细胞大规模常温消化方法


[0001]本专利技术涉及牙髓干细胞
，具体涉及一种牙髓干细胞大规模常温消化方法。

技术介绍

[0002]牙髓干细胞是一种存在于人牙髓组织中具有高度增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞，来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低，较其他间充质干细胞更具有优势，已成功用于牙齿、骨、神经、肌肉、角膜等组织重建及再生等临床应用研究，在组织工程修复和再生医学中有广泛的应用前景。尤其在牙周组织再生方面，“人牙髓间充质干细胞注射液”已获国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）临床默示许可，有望为人类慢性牙周炎的再生治疗提供新的治疗药物和方法。
[0003]牙髓干细胞作为再生医学重要的细胞来源之一，体外培养获得大量质量稳定的干细胞是牙髓干细胞进入临床应用的前提条件。然而牙髓组织量少，需在体外进行大量扩增得到足量的细胞。牙髓干细胞呈贴壁生长，每扩增一代需进行一次消化。消化是利用消化酶通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞在自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞间分离。因而细胞消化是影响细胞生长状态好坏的关键因素之一。
[0004]目前牙髓干细胞常规的消化方法，是在生物安全柜中加入胰酶后，放入37℃培养箱进行消化，然后在倒置相差显微镜下观察细胞消化情况，再转移至生物安全柜中吹打，收集细胞悬液离心去除胰酶，加培养基用于后续培养。在消化过程中，细胞来回进出生物安全柜，人员频繁走动，增加细胞污染的风险，而且消化过程占用培养箱和显微镜，因37℃胰酶作用时间短使得单次处理瓶数有限，消化后需离心去除胰酶，造成一定的细胞损耗和离心对细胞的损伤。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的缺陷，本专利技术提供一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，减少细胞污染的风险，操作更加连贯；节省了耗材和培养基用量，降低成本；且无需占用培养箱和显微镜；无需离心，提高了细胞的增殖活力；提升了单次处理瓶数；缩短了细胞消化操作时间；提高了牙髓干细胞消化工艺的生产效率。
[0006]本专利技术采用的技术解决方案是：一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，包括以下步骤：（1）从培养箱中取出具有牙髓干细胞的培养瓶喷酒精后放至生物安全柜；（2）倒液弃培养基上清液；（3）加入DPBS清洗培养瓶并倒液弃除；（4）加入重组胰酶，温和摇动培养瓶使重组胰酶浸润细胞后立即弃除重组胰酶；（5）放倒培养瓶在生物安全柜台面上，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显
时，轻轻拍打培养瓶细胞面；（6）倒入培养基终止消化；（7）水平方向前后摇晃培养瓶使细胞从培养瓶上脱落，倒液转移至储液瓶，用移液管吹打细胞悬液至单细胞，即完成消化。
[0007]所述的培养瓶内的牙髓干细胞为传代的牙髓干细胞。
[0008]所述的步骤（4）中弃除重组胰酶采用浸润后倒液弃除的方式。
[0009]所述的步骤（3）中加入DPBS的量为2-10ml。
[0010]所述步骤（4）中加入的重组胰酶的量为1-5ml。
[0011]所述步骤（5）中常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显的时间为60-180s。
[0012]所述步骤（6）中加入的培养基为5-10ml。
[0013]本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种牙髓干细胞大规模常温消化方法, 通过比较几种消化方式对细胞的影响，优化消化方式，在常温条件下实现大规模消化生产，整个消化操作在生物安全柜中进行，减少细胞污染的风险，操作更加连贯；节省了耗材和培养基用量，降低成本；且无需占用培养箱和显微镜；无需离心，提高了细胞的增殖活力；提升了单次处理瓶数；缩短了细胞消化操作时间；提高了牙髓干细胞消化工艺的生产效率。
附图说明
[0014]图1为细胞消化前后细胞状态图；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
[0015]图2为不同消化方式对细胞状态的影响；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
[0016]图3为不同消化方式牙髓干细胞胰酶作用时间比较；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
[0017]图4为不同消化方式牙髓干细胞收获细胞量结果；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
[0018]图5为不同消化方式对牙髓干细胞增殖曲线的影响；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
[0019]图6为大规模消化操作步骤用时比较（s）；其中常规消化(A)，弃胰酶常温消化不离心(C)。
具体实施方式
[0020]下面结合附图以及具体实施例，可以更好地说明本专利技术。
[0021]一、筛选最适的常温消化方式1、细胞复苏培养：从细胞库中取1管P2代的牙髓干细胞，进行复苏，加入无血清培养基接种至1个T25，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。待牙髓干细胞融合度达到90%左右时，用常规消化方式消化，P4代接种1个T75培养瓶，P5代接种12个T25培养瓶。
[0022]2、不同消化方式：取P5代12瓶T25细胞，按表1随机分为A、B、C、D 四组，每组3瓶，消化前对细胞进行拍照。
[0023]表1 不同消化方式分组情况
分组分组名称消化环境消化时是否弃胰酶消化后是否离心去除胰酶A常规消化37℃培养箱否是B含胰酶常温消化常温否是C弃胰酶常温消化（不离心）常温是否D弃胰酶常温消化（离心）常温是是
每组具体消化方式为：A组常规消化：弃培养基上清，加入2mlDPBS清洗细胞，加入1 ml重组胰酶浸润，放至37℃ CO2培养瓶，消化约40s，移至倒置相差显微镜下至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，拍照，记录每瓶胰酶作用时间，轻轻拍打培养瓶细胞面，加入5 ml培养基终止消化，吹打细胞成单细胞悬液，离心弃上清去除残留的重组胰酶，加入培养基重悬；B组含胰酶常温消化：弃培养基上清，加入2mlDPBS清洗细胞，加入1 ml重组胰酶浸润，放至倒置相差显微镜下，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，拍照，记录每瓶胰酶作用时间，轻轻拍打培养瓶细胞面，加入5 ml培养基终止消化，吹打细胞成单细胞悬液，离心弃上清去除残留的重组胰酶，加入培养基重悬；C组弃胰酶常温消化（不离心）：弃培养基上清，加入2mlDPBS清洗细胞，加入1 ml重组胰酶浸润后立即弃除重组胰酶，放至倒置相差显微镜下，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，拍照，记录每瓶胰酶作用时间，轻轻拍打培养瓶细胞面，加入5 ml培养基终止消化，吹打细胞成单细胞悬液；D组弃胰酶常温消化（离心）：弃培养基上清，加入2mlDPBS清洗细胞，加入1 ml重组胰酶浸润后立即弃除重组胰酶，放至倒置相差显微镜下，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）从培养箱中取出具有牙髓干细胞的培养瓶喷酒精后放至生物安全柜；（2）倒液弃培养基上清液；（3）加入DPBS清洗培养瓶并倒液弃除；（4）加入重组胰酶，温和摇动培养瓶使重组胰酶浸润细胞后立即弃除重组胰酶；（5）放倒培养瓶在生物安全柜台面上，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，轻轻拍打培养瓶细胞面；（6）倒入培养基终止消化；（7）水平方向前后摇晃培养瓶使细胞从培养瓶上脱落，倒液转移至储液瓶，用移液管吹打细胞悬液至单细胞，即完成消化。2.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，其特征在于，所述的培养瓶内的牙髓干细胞为传代的牙髓干细胞。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶青松，郑丽娜，杨多佳，贺捷，陈以列，夏蒙婷，贺燕，
申请(专利权)人：浙江优牙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：