一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备及外泌体乳霜的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备及外泌体乳霜的制备方法，其中制备方法包括：将人脐带间充质干细胞置于培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养；直到细胞达60％

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备及外泌体乳霜的制备方法


[0001]本专利技术涉及护肤品领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法及外泌体乳霜的制备方法。

技术介绍

[0002]人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesnchymalstem cells，hUCMSC)是来源于新生儿脐带组织的一种具有自我更新能力、多向分化多潜能和较强免疫调节功能的间充质干细胞，它具有干细胞的所有共性。通过体外无血清培养上清的蛋白质组学分析发现，UCMSC可分泌数百种涉及细胞生长、分化、合成、代谢相关的因子，其中至少有30种以上可促进损伤组织的原位细胞分裂增殖、血管再生、抑制炎症反应等有利于促进损伤修复的因子，hUCMSC能分泌多种细胞因子和外泌体。外泌体(exosome，Exo)活细胞分泌的直径为30-150nm的双层膜性囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为
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exosome
″
，即外泌体。外泌体起源于细胞内吞过程中形成的内体，最后再从细胞中释放到胞外。人体几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，外泌体广泛存在并分布于各种体液中(包括血液、唾液、尿液和母乳)，作为重要的传递信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，如图1a-图1b所示。研究表明hUCMSC来源的外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA和脂质类物质等，具有组织修复、免疫调节等多种功能。与传统的干细胞疗法不同，外泌体是活细胞分泌的囊泡，因此在被注射到身体的受损伤部位后，不会发展成为癌细胞。因此，外泌体作为替代间充质干细胞治疗的新策略正在迅速获得重视，并且能够克服细胞治疗中的诸多风险和困难。
[0003]目前市场上大多数美容制剂的活性成分单一，个体针对性不强，产品效果不佳，只是通过遮掩瑕疵或在皮肤的表层起作用，且产品同质化严重。而hUCMSC来源的外泌体内含细胞生长和分化所需要的各种营养和物质信息，可快速激活人体的修护系统，根据不同肌肤问题进行智能修护和护理。因此，开发一种能够发挥媲美干细胞因子的最佳修护功效的美容制剂是亟待解决的问题。
[0004]中国专利文献CN110317783A公开了一种脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法和护肤品。该脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法包括以下步骤：培养脐带间充质干细胞，在细胞融合度为85％～95％时，收集培养上清；去除培养上清中的脐带间充质干细胞、细胞碎片和细胞器，得到粗提液；用孔径为0.22μm的滤膜过滤粗提液，得到滤液；及在将滤液离心，得到脐带间充质干细胞的外泌体。上述脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法得到的外泌体的产量多且纯度高。护肤品以质量份数计，透明质酸的份数为1份～5份、甘油的份数为5份～15份、胶原蛋白的份数为0.5份～2份、茶多酚的份数为0.2份～1份，寡肽-5的份数为0.1份～0.5份，白细胞提取物的份数为0.01份～0.02份，脐带间充质干细胞的外泌体的份数为0.001份～0.1份。
[0005]中国专利文献CN110548001A公开了一种含脐带间充质干细胞外泌体的修复抗衰
护肤品，包括以下成分：间充质干细胞外泌体、甘露醇、EDTA-2Na、黄原胶、丁二醇、甘油、水溶性霍霍巴油、橄榄油、聚二甲基硅氧烷、羟乙基纤维素、氢化卵磷脂、枯草杆菌脂肽钠、PCA Na、尿素、透明质酸、β-葡聚糖、干细胞分泌素、血清白蛋白、神经酰胺-2和水。其中间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：A、取胎盘，分离出绒毛膜，用PBS缓冲液冲洗去除红细胞，将绒毛膜剪成10～20mm3大小的组织块，加入胶原酶消化液进行消化；B、取消化后的组织块，过滤得滤液1，剩余组织加入用胰蛋白酶进行，消化后，组织悬块过滤得滤液2；合并滤液1和滤液2，加入血清终止消化，离心，弃去上清，收集离心获得的细胞；C、将细胞以2
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106/cm2的密度接种至含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2、饱和湿度下培养，每隔一段时间换液一次并去除未贴壁细胞；待细胞融合率达到80％～90％时，消化细胞进行传代培养；等扩增到所需数量时，离心去除细胞以及碎片等，收集上清，过0.22μm无菌滤膜，加入终浓度为10％的聚乙二醇，混匀，4℃孵育8～14小时，离心，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为8％的聚乙二醇，再次孵育1小时，离心，PBS缓冲液重悬沉淀，即得间充质干细胞外泌体，分装，-80℃保存。该专利技术的含脐带间充质干细胞外泌体的修复抗衰护肤品，可有效保证干细胞外泌体的活性，并在无防腐剂和乳化剂的情况下最大限度地保证因子活性，配合多种肌肤养护成分，能够更好地修复肌肤屏障。
[0006]中国专利文献CN107510098A公开了一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液及其制备方法与应用，涉及电子烟。其原料组成按质量百分比为：65％～80％丙二醇、1％～2％香料、15％～20％甘油、5％～15％水，另外包含脐带间充质干细胞外泌体，脐带间充质干细胞外泌体的含量为1mg/g。脐带间充质干细胞外泌体的制备方法为：将P3代脐带间充质干细胞种植于T175细胞培养瓶中，当细胞融合后清洗，然后更换无血清培养基继续培养，收集细胞上清用于外泌体分离制备；然后根据CapturemTMExosome Isolation Kit的使用说明进行外泌体的分离制备。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提出一种一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法及外泌体乳霜的制备，用人脐带间充质干细胞外泌体提取液制备的乳霜能够改善细胞分裂并分泌出大量的细胞外基质帮助完成肌肤细胞的更新，改善细胞状态。
[0008]所采用的技术方案为：
[0009]一种脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法，包括如下步骤：
[0010]S1.将人脐带间充质干细胞置于培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养；
[0011]S2.直到细胞达60％-70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12-16h；
[0012]S3.将无血清的饥饿培养液换为含有表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF和角质细胞生长因子KGF的DMEM/F12培养液，培养至细胞处于对数生长期，收集细胞培养上清液；
[0013]S4.将细胞培养上清液梯度离心，将离心所得的上清液用滤器过滤，得到人脐带间充质干细胞外泌体提取液。
[0014]进一步地，S3中，含有表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF的DMEM/F12培养液，其细胞因子浓度为10-20ng/ml。
[0015]进一步地，S1中，人脐带间充质干细胞是以脐带组织块为原代，以DMEM/F12培养基为基础，按原代培养密度1:3的比例进行传代培养，选择P2-P5代的人脐带间充质干细胞。
[0016]进一步地，S1中，人脐带间充质干细胞是以脐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将人脐带间充质干细胞置于培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养；S2.直到细胞达60％-70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12-16h；S3.将无血清的饥饿培养液换为含有表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF的DMEM/F12培养液，培养至细胞处于对数生长期，收集细胞培养上清液；S4.将细胞培养上清液梯度离心，将离心所得的上清液用滤器过滤，得到人脐带间充质干细胞外泌体提取液。2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法，其特征在于，S3中，含有表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF的DMEM/F12培养液，其细胞因子浓度为10-20ng/ml。3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法，其特征在于，S1中，人脐带间充质干细胞是以脐带组织块为原代，以DMEM/F12培养基为基础，按原代培养密度1:3的比例进行传代培养，选择P2-P5代的人脐带间充质干细胞。4.根据权利要求3所述的脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法，其特征在于，S1中，人脐带间充质干细胞是以脐带组织块为原代，原代的细胞培养环境是VitroGel 3D与DMEM培养基混合形成的多糖水凝胶体系，其中VitroGel 3D的稀释比例为1:1，然后与DMEM...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘先苗，刘先春，
申请(专利权)人：深圳玄鸟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：