无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养领域，尤其是无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法。无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，包含以下步骤：a.收集一脂肪组织；b.以一脂溶性组合物溶解所述脂肪组织中的成熟脂肪；所述脂溶性组合物不含有酵素；c.离心以将所述经溶解成熟脂肪的脂肪组织中固态与液态的部分分离；d.将所述脂肪组织中固态的部分分成一外植体片；e.将所述外植体片进行干燥；f.使所述外植体片浸于一脂肪间质干细胞培养基中，成为一外植体培养组合物并进行培养；g.从所述外植体培养组合物中得到一目标脂肪间质干细胞。本发明专利技术所述方法能够在离体培养的环境下获得相当数量的脂肪间质干细胞，容易、安全、快速、便宜、且更有效。且更有效。

【技术实现步骤摘要】
无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，尤其是无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法。

技术介绍

[0002]间质干细胞最初在骨髓中被发现，随后在多种组织中，包括皮下脂肪组织也被证实含有间质干细胞，其中脂肪组织是间质干细胞的丰富来源，且相对较容易获得，可适用于组织工程和再生医学应用。许多文献证明该脂肪来源的间质干细胞(Adipose Derived Stromal Cells,ADSCs)的多能性，其具有分化成软骨、硬骨和脂肪细胞的潜力。
[0003]Rodbell等学者在1960年代开创了传统，且同时也是最被广为使用的从脂肪组织中分离基质血管部份(Stromal vascular fraction,SVF)，并在体外培养扩增间质干细胞的方法，该方法最初是用于分离脂肪组织中的脂肪细胞(Adipocytes)。此方法是先切碎大鼠的脂肪垫(Fat pad)，并洗去大部分的血液细胞后，再加入胶原蛋白水解酶(Collagenase)以进行组织分解作用，而后再利用离心的方式，将成熟的脂肪细胞群与基质血管部分的沉淀物进行分离，再将基质血管部分培养扩增以得到脂肪间质干细胞。基质血管部分是一种异质的细胞群(Heterogenous cell population)，其中包含血液细胞(Blood cells)、血液干细胞(Hematopoietic stem cells)、纤维母细胞(Fibroblasts)、周边细胞(Pericytes)、内皮细胞(Endothelial cells)、脂肪前驱细胞(Pre-adipocytes)、及间质干细胞(ADSCs)等不同的细胞种类，尔后再以红血球溶解缓冲溶液(RBC lysis buffer)作用，以裂解并除去基质血管部分中的红细胞；因此，可基于间质干细胞具有粘附到细胞培养皿表面的能力，从中分离与扩增脂肪间质干细胞。
[0004]新兴的再生医学领域需要可靠的干细胞来源。脂肪组织已被证明可作为成体多能性干细胞的丰富来源且相对容易取得，符合组织工程和再生医学应用的性质。目前的基质血管部分的分离方式需要使用胶原蛋白酶，其浓度范围为0.075-0.1％；其中，胶原蛋白水解酶是来自溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)，该酵素的分解效率是依据酵素的质量和浓度而有不同，例如粗萃取(Crude extract)或纯化(Purified)，以及有无并用其他蛋白水解酶如中性蛋白水解酶(Dispase)或嗜热菌蛋白水解酶(Thermolysin)。但胶原蛋白水解酶的来源及其残留，皆会对未来于临床应用时造成安全上的疑虑，因此目前美国食品药品监督管理局(Food and drug adminis-tration,FDA)并未核准该种利用胶原蛋白酶产出脂肪间质干细胞于临床的应用。
[0005]综合上面所述，开发一种实用且不使用酵素即可进行脂肪间质干细胞的培养，又能同时提高脂肪间质干细胞扩增率的方法，着实有其必要性。

技术实现思路

[0006]缘此，本专利技术的一目的在提供一种无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSCs)的方法，包含以下步骤：a.收集一脂肪组织；b.以一脂溶性组合物(Lippodissolve composition)溶解该脂肪组织中的成熟脂肪，其中该
脂溶性组合物不含有酵素；c.离心以将该经溶解成熟脂肪的脂肪组织中固态与液态的部分分离；d.将该脂肪组织中固态的部分分成一外植体片；e.将该外植体片进行一干燥步骤；f.使该外植体片浸于一脂肪间质干细胞培养基中，成为一外植体培养组合物(Explant culture composition)并进行培养；以及g.从该外植体培养组合物中得到目标的脂肪间质干细胞，且步骤b的该脂溶性组合物不含有酵素。
[0007]在本专利技术的一实施例中，该步骤g中所得的脂肪间质干细胞保留其原始的细胞特性。
[0008]在本专利技术的又一实施例中，该步骤a的脂肪组织是取自一个体的皮下(Subcutaneous)、内脏脂肪垫(Visceral fat pad)、或脂肪抽吸物(Lipoaspirate)。
[0009]在本专利技术的又一实施例中，该步骤f的该外植体培养组合物包含一间质干细胞组合物(Stromal cell composition)，且该间质干细胞组合物包含源自哺乳类动物的脂肪组织的间质干细胞群；且该间质干细胞群包含一血液细胞(Blood cells)、一血液干细胞(Hematopoietic stem cells)、一纤维母细胞(Fibroblasts)、一周边细胞(Pericytes)、一内皮细胞(Endothelial cells)、一脂肪前驱细胞(Pre-adipocytes)、脂肪细胞(Adipocytes)、及/或一间质干细胞(ADSCs)。
[0010]在本专利技术的又一实施例中，该步骤b的脂溶性组合物包含一生理食盐水、以及一能溶解脂肪组织的脂溶性材料；且以该脂溶性组合物溶解该脂肪组织中的成熟脂肪的反应时间为5-10分钟；其中，该脂溶性组合物中该生理食盐水浓度为99％、且该能溶解脂肪组织的脂溶性材料浓度为1％；且该能溶解脂肪组织的脂溶性材料是为必需磷脂(Phospholipid essential)、及/或磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine)；且该必需磷脂或该磷脂酰胆碱在该脂溶性材料中的浓度是为40-60mg/mL，其中浓度较佳为50mg/mL。
[0011]在本专利技术的又一实施例中，该步骤d的外植体片是将该脂肪组织中固态的部分剪碎成为一直径约5至10毫米的组织块；并以适当间距置于细胞培养皿内；该步骤e的干燥步骤是将该外植体片干燥20-30分钟；且该步骤f的脂肪间质干细胞培养基包含89-97％的αMEM、2-10％的人血小板裂解物(Human platelet lysate,HPL)、及1％的抗生素。
[0012]本专利技术所提供的无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，其中该间质干细胞是由脂肪组织中提取，间质干细胞具有贴附培养皿生长的特征，然而脂肪组织中过多的脂肪分子，会阻碍该些间质干细胞的贴附，因此本专利技术使用天然存在于人体中的接口活性剂，以皂化并溶解脂肪组织中的成熟脂肪，使得脂肪组织中的间质干细胞能够直接暴露于培养皿上，并增加该间质干细胞与培养皿的接触面积，以达到较佳的贴附率及细胞培养产出率。
[0013]本专利技术所提供的无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，能够在离体培养的环境下获得相当数量的脂肪间质干细胞，且相较于传统的方法，亦较为容易、安全、快速、便宜、且更有效，并且更加符合细胞组织优良操作规范(Good Tissue Practice)，使得本专利技术无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法更能有效地应用于未来组织工程和再生医学。
[0014]以下将进一步说明本专利技术的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本专利技术，并非用以限定本专利技术的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，包含以下步骤：a.收集一脂肪组织；b.以一脂溶性组合物溶解所述脂肪组织中的成熟脂肪；c.离心以将经溶解成熟脂肪的脂肪组织中固态与液态的部分分离；d.将所述脂肪组织中固态的部分分成一外植体片；e.将所述外植体片进行干燥；f.使所述外植体片浸于一脂肪间质干细胞培养基中，成为一外植体培养组合物并进行培养；以及g.从所述外植体培养组合物中得到一目标脂肪间质干细胞；其中，步骤b的所述脂溶性组合物不含有酵素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤g中所得的脂肪间质干细胞保留其原始的细胞特性。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a的脂肪组织是取自一个体的皮下、内脏脂肪垫、或脂肪抽吸物。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f的所述外植体培养组合物皆包含一间质干细胞组合物，且所述间质干细胞组合物包含源自哺乳类动物的脂肪组织的一间质干细胞群。5.根据权利要求3所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：周遵善，许家宜，翁紫妍，顾文晴，
申请(专利权)人：海峡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：