一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液技术

一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液，相较于现有的牙齿根尖部分切开的牙髓组织冻存方法复苏后组织块细胞爬出时间较短，爬出细胞状态较好，细胞传代后细胞呈涡旋状排列，排列相对紧密，边缘清晰透光性好，形态多为长梭形，效果接近于原代提取的牙髓干细胞。

A method of pulp tissue serum-free cryopreservation and resuscitation and cryopreservation solution

【技术实现步骤摘要】
一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液
本专利技术涉及干细胞培养
，特别涉及一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液。
技术介绍
牙髓位于牙髓腔内，是牙体组织中主要包含神经血管的疏松结缔组织，2000年，Gronthos等[GronthosSM,BrabimJ.Postnatalhumandentalpulpstemcells(DPSCs)invitroandinvivo.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(25):13625-13630.]通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞形态呈梭形，可多向分化，有着较强的克隆能力，这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞称为牙髓干细胞(DentalPulpStemCells,DPSCs)。目前采用冻存方式来保存组织和细胞，但冻存过程中使用的冻存液由于存在大量的胎牛血清虽然可以为细胞提供必要的营养物质，，但也因为其成分不明确而存在携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险而且还有可能引起免疫反应，来源生产批次差异可能会造成不一致的影响，容易对干细胞生物学特性产生干扰，且为后续干细胞制品的分离纯化造成一定的困难。而在冻存方法上，专利(一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存，申请公布号CN105941390A)采用牙齿根尖部分切开方式进行冻存，因此本专利对根尖部分切开冻存及牙髓组织冻存两种方式进行对比，结果表明牙髓组织冻存方式的组织块细胞爬出时间较短，爬出的细胞状态较好。因此专利技术一种适合牙髓组织冻存、保持牙髓干细胞活性的无血清冻存液及冻存复苏方法尤为重要。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液，使牙髓组织复苏后原代提取的牙髓干细胞依旧保持活力及生物学特性。本专利技术采用的技术解决方案是：一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，包括以下步骤：(1)提取牙髓：采集完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入浓度为75％的医用酒精，没过牙齿30s，吸去医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至完全去除牙齿表面的医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓；(2)配制牙髓冻存液：所述的牙髓冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％CryosureDEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液；(3)冻存牙髓：将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙髓完全浸没于冻存液中，将冻存管放置在装有异丙醇的程序冻存盒中，随后将程序冻存盒放置于-80℃条件下过夜，然后液氮永久保存；(4)牙髓复苏：取冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后在牙髓组织中加入消化液，将牙髓剪成0.5mm3的组织块，消化10min，加无血清培养基终止消化，离心，弃上清，加入原代培养基700μL，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补培养液，之后半量换培养液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。所述的步骤(4)中消化液由浓度12mg/mL中性蛋白酶和浓度12mg/mLⅠ型胶原酶以及PBS组成，所述的中性蛋白酶：Ⅰ型胶原酶：PBS的体积比＝1:1:2。所述的步骤(4)中第2天补培养液为1mL。所述的步骤(2)中血清替代物包括生长因子、激素、蛋白质、维生素及还原类物质、促贴壁物质、酶抑制剂以及微量元素。一种牙髓组织冻存液，所述的牙髓组织冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％CryosureDEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液，所述的血清替代物由生长因子、激素、蛋白质、维生素及还原类物质、促贴壁物质、酶抑制剂以及微量元素组成。所述的生长因子由PDGF-AB、PDGF-BB、FGF、EGF、TGF-β1和bFGF组成。所述的维生素及还原类物质由氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、维生素B3、维生素B6、维生素B12、肌醇、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸中的一种或几种组成。所述的促贴壁物质由胶原蛋白和纤连蛋白组成，所述的酶抑制剂为抗凝血酶Ⅲ，所述的微量元素由钠离子、磷离子、钙离子、镁离子、钾离子、氯化物、铁离子中的一种或几种组成，所述的所述的其他物质由胆固醇、胆红素、葡萄糖、甘油三酯、肌酐、AST、CPK、γ-GT、CK、GGT、重碳酸盐中的一种或几种组成，。所述的生长因子中添加浓度为PDGF-AB：21.45-60.49ng/mL、PDGF-BB：13.57-32.63ng/mL、FGF：3.76-14.5ng/mL、EGF：3-6.12ng/mL、TGF-β1：74.45-133.84ng/mL、bFGF：40.71-97.89ng/mL。生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。所述的激素中胰岛素的添加浓度为0.1-10μg/ml。激素如胰岛素、生长激素、胰高糖素等。几乎所有的细胞系都需要胰岛素，它是一种多肽，能与细胞上的胰岛素受体结合形成复合物，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子。所述的蛋白质中添加浓度为球蛋白：1.8-2g/dL、白蛋白：3.0-3.6g/dL。蛋白质如转铁蛋白、球蛋白、白蛋白等能够运输维生素、脂类等营养物质，促进细胞新陈代谢以及保护细胞不受蛋白酶的损伤。所述的维生素及还原类物质中添加浓度为氯化胆碱0.5-0.8mg/dL、D-泛酸钙1-3mg/dL、叶酸0.1-3mg/dL、烟酰胺0.2-0.3mg/dL、盐酸吡哆醇0.01-0.03mg/dL、核黄素0.1-0.5mg/dL、维生素B35-10mg/dL、维生素B60.1-1mg/dL、维生素B120.1-0.8mg/L、肌醇1-3mg/dL、甘氨酸2-4mg/dL、L-丙氨酸4-6mg/dL、L-精氨酸4-6mg/dL、L-天冬酰胺5-15mg/dL、L-天冬氨酸7-8mg/dL、L-半胱氨酸4-6mg/dL、L-谷氨酸3-5mg/dL、L-谷氨酰胺1-4mg/dL、L-组氨酸盐酸盐5-8mg/dL、L-异亮氨酸4-6mg/dL、L-亮氨酸4-6mg/dL、L-赖氨酸盐酸盐9-10mg/dL、L-蛋氨酸1-5mg/dL、L-苯丙氨酸2-5mg/dL、L-脯氨酸1-2mg/dL、L-丝氨酸2-3mg/dL、L-苏氨酸5-6mg/dL、L-色氨酸5-10mg/dL、L-酪氨酸3-4mg/dL和L-缬氨酸5-10mg/dL。所述的促贴壁物质中添加浓度为胶原蛋白10-50μg/ml、纤连蛋白10-50μg/ml。促贴壁物质可促进细胞贴壁生长。所述的酶抑制剂抗凝血酶Ⅲ添加浓度为0.01-1mg/mL。添加酶抑制剂的目的是终止消化时不需要额外使用酶抑制剂，只用培养基终止消化即可。所述的其他物质中添加浓度为胆固醇：125-135mg/dL、胆红素：0.2-0.4mg/d本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取牙髓：采集完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入浓度为75％的医用酒精，没过牙齿30s，吸去医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至完全去除牙齿表面的医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓；(2)配制牙髓冻存液：所述的牙髓冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX‑4组成的无血清培养体系‑基础培养基组成的冻存液；(3)冻存牙髓：将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙髓完全浸没于冻存液中，将冻存管放置在装有异丙醇的程序冻存盒中，随后将程序冻存盒放置于‑80℃条件下过夜，然后液氮永久保存；(4)牙髓复苏：取冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后在牙髓组织中加入消化液，将牙髓剪成0.5mm

【技术特征摘要】
1.一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取牙髓：采集完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入浓度为75％的医用酒精，没过牙齿30s，吸去医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至完全去除牙齿表面的医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓；(2)配制牙髓冻存液：所述的牙髓冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％CryosureDEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液；(3)冻存牙髓：将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙髓完全浸没于冻存液中，将冻存管放置在装有异丙醇的程序冻存盒中，随后将程序冻存盒放置于-80℃条件下过夜，然后液氮永久保存；(4)牙髓复苏：取冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后在牙髓组织中加入消化液，将牙髓剪成0.5mm3的组织块，消化10min，加无血清培养基终止消化，离心，弃上清，加入原代培养基700μL，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补培养液，之后半量换培养液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。2.根据权利要求1所述的一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，所述的步骤(4)中消化液由浓度12mg/mL中性蛋白酶和浓度12mg/mLⅠ型胶原酶以及PBS组成，所述的中性蛋白酶：Ⅰ型胶原酶：PBS的体积比＝1:1:2。3.根据权利要求1所述的一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，所述的步骤(4)中第2天补培养液为1mL。4.根据权利要求1所述的一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，所述的步骤(2)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶青松，郑平平，贺捷，夏蒙婷，王槐幸，贺燕，
申请(专利权)人：浙江优牙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33