本发明专利技术公开了基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及由其制备的猪圆环疫苗和应用。本发明专利技术将猪圆环病毒的衣壳蛋白与自组装铁蛋白纳米颗粒亚基N端融合进行表达，将猪圆环病毒衣壳蛋白展示在自组装铁蛋白笼形结构表面。本发明专利技术进一步获得该融合蛋白的同感序列并进行密码子优化，在优化后序列上进行氨基酸单位点，双位点和多位点突变，显著提升了可溶性表达量和表达效率，提高了猪圆环疫苗的免疫效力与宽度，有效提高了猪圆环病毒衣壳蛋白的免疫原性。本发明专利技术利用大肠杆菌原核表达系统、家蚕AcMNPV-昆虫细胞真核表达系统来表达融合蛋白并制备得到猪圆环疫苗，或者通过重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行融合蛋白抗原基因呈递产生抗原诱导抗体产生。递产生抗原诱导抗体产生。递产生抗原诱导抗体产生。
【技术实现步骤摘要】
基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及由其制备的猪圆环疫苗和应用
[0001]本专利技术涉及基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒，尤其涉及包含由猪圆环病毒衣壳蛋白和单体铁蛋白亚基融合在一起的纳米抗原颗粒以及由该纳米颗粒抗原制备的猪圆环疫苗，属于猪圆环疫苗领域。
技术介绍
[0002]猪圆环病毒感染是由猪圆环病毒所引起的一系列疾病的总称，通常是哺乳期和保育期的仔猪容易感染，易感性较强，猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，基因组为单股环状DNA，有3个血清型，PCVI、PCV-II和PCV-III，只在猪源细胞上增殖，不产生细胞病变，对外界的抵抗力强，可耐受pH 3的酸性环境，猪圆环病毒病是全球公认的危害养猪业的重要疫病，可造成T、B淋巴细胞在外周血中含量降低，并可诱导CD4、CD8等细胞凋亡，造成免疫抑制，不仅造成该类疫苗的免疫失败，而且容易继发或并发副猪嗜血杆菌、猪附红细胞体、猪蓝耳病、伪狂犬等病原，因此，研发高效、安全、廉价的PCV疫苗成为防控该病的必然趋势。
[0003]近年来，纳米生物学被认为是纳米技术中最有潜力的领域之一，铁蛋白是最为常见的纳米颗粒，广泛应用于多个领域。其具有纳米尺寸的水和氧化铁内核和笼状结构的蛋白质外壳，且铁蛋白非常稳定，能够耐受高温和多种变性剂而不影响其天然蛋白结构，对pH较敏感，在酸性条件下蛋白质外壳发生解体，当pH恢复到生理条件时，解体的蛋白亚基又能重新组装成完整的铁蛋白，通过改变溶液的pH使其解聚和重组装向铁蛋白腔内装载药物或纳米颗粒。近年来对铁蛋白的研究主要集中在通过对铁蛋白内表面的修饰使铁蛋白壳内包裹上特定药物或者促进纳米材料的合成，对铁蛋白外表面的修饰与PEG或抗体连接以扩展新的功能，通过铁蛋白外表面或亚基间接触面的修饰控制铁蛋白的自组装。铁蛋白纳米颗粒展示抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，因此铁蛋白是理想的纳米疫苗平台。
[0004]因此，研制一种基于自组装铁蛋白纳米颗粒将猪圆环病毒的抗原展示在该自组装铁蛋白笼形结构表面，能够显著地增强抗原的免疫原性，对于PCV的防治将具有重要的意义。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的之一是提供一种包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒；
[0006]本专利技术的目的之二是将所述融合蛋白进行突变进而提高融合蛋白的表达量或表达效率；
[0007]本专利技术的目的之三是提供基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒得到的纳米颗粒猪圆环疫苗；
[0008]本专利技术目的之四提供高效表达所述融合蛋白的方法；
[0009]本专利技术目的之五是提供一种将自组装铁蛋白纳米颗粒与衣壳蛋白所构建的融合基因呈递给动物体内并在动物体内呈递抗原诱导产生抗体的方法。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0011]本专利技术首先提供了一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，所述融合蛋白由猪圆环病毒衣壳蛋白和单体铁蛋白亚基的N端连接得到；优选的，将猪圆环病毒衣壳蛋白和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白。
[0012]所述单体铁蛋白亚基包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单体，其序列为WP_000949190所示的氨基酸序列。
[0013]所述猪圆环病毒衣壳蛋白是PCV-II病毒衣壳蛋白或PCV-III病毒衣壳蛋白；优选的，所述猪圆环病毒衣壳蛋白所选区域包含选自以下区域：能够容许衣壳三聚体形成的区域、茎区、胞外结构域；最优选的，所述PCV-II病毒衣壳蛋白选取PCV-II病毒完整衣壳蛋白部分，所述PCV-II病毒衣壳蛋白的序列为WP_000949190所示的氨基酸序列；所述PCV-III病毒衣壳蛋白选取PCV-III病毒完整衣壳蛋白部分，所述PCV-III病毒衣壳蛋白的序列为APA21932.1所示的氨基酸序列；
[0014]作为本专利技术的一种优选的实施方式，本专利技术所提供的一种原始融合蛋白(PCV-II CAP-Ferritin)包括铁蛋白单体序列(WP_000949190)和PCV-II病毒衣壳蛋白(AMJ50231.1)；本专利技术所提供的另一种原始融合蛋白(PCV-III CAP-Ferritin)包括铁蛋白单体序列(WP_000949190)和PCV-III病毒衣壳蛋白序列(APA21932.1)。
[0015]为了提高猪圆环病毒衣壳蛋白与铁蛋白单体连接后得到的原始融合蛋白的表达量，本专利技术进一步将两种原始融合蛋白(PCV-II CAP-Ferritin和PCV-III CAP-Ferritin)融合蛋白的同感序列进行突变优化并在序列优化之后进行糖基化位点分析以消除糖基化位点来增加可溶性表达，进而在同感序列优化之后进行氨基酸单位点突变，双位点突变和多位点突变，以提高其可溶性表达量和表达效率：
[0016]具体的，本专利技术通过分析了17条最近年份，流行于不同地区的PCV-II、PCV-III毒株的衣壳蛋白氨基酸序列进行比对分析，找出一条最为通用的同感序列，作为相应毒株的抗原基因，以期取得最佳的保护效果；在此基础上，本专利技术进一步利用OptimumGene
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技术对PCV-II、PCV-III衣壳蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的衣壳蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据大肠杆菌密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。此外，为了提高铁蛋白的表达量，同时提高可溶表达对铁蛋白单体亚基进行点突变N19Q；最终，PCV-II的原始融合蛋白的同感序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，按照上述方式将该编码基因的序列进行优化得到的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；PCV-III的原始融合蛋白的同感序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，按照上述方式将该编码基因的序列进行优化得到的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
[0017]本专利技术将优化后的同感序列在家蚕表达系统中进行表达，根据基因表达产物ELISA效价结果可见，密码子优化后的同感序列的表达量相比优化前有了显著提高。
[0018]本专利技术获得了PCV-II CAP-Ferritin-C、PCV-III CAP-Ferritin-C突变体，以PCV-II CAP-Ferritin-C、PCV-III CAP-Ferritin-C突变体密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对保守序列进行定点突变：
[0019]将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照R12D、Q21H、R35S、L49T、V62Q、F74K、P88T、F105D、V118S、A13本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
N204T、A133E-P176S、A133E-N204T或P176S-N204T中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体；优选的，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照Q21H-1133E、F74K-A133E或F105D-A133E中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体；最优选的，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照F74K-A133E氨基酸双位点突变获得的双位点突变体；或者，将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照K27S-W60H、K27S-A75E、K27S-M103R、K27S-Y176K、K27S-W207H、W60H-A75E、W60H-M103R、W60H-Y176K、W60H-W207H、A75E-M103R、A75E-Y176K、A75E-W207H、M103R-Y176K、M103R-W207H或Y176K-W207H中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体；优选的，将氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸按照K27S-Y176K、W60H-Y176K或Y176K-W207H中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体；最优选的，将氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸按照W60H-Y176K氨基酸双位点突变获得的双位点突变体。7.按照权利要求4所述的包含融合蛋白的纳米抗原...
【专利技术属性】
技术研发人员：张志芳，李轶女，胡小元，易咏竹，刘兴健，杜梦潭，宋浩志，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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