一种靶向CKIP-1的用于检测骨质疏松症的荧光探针及其在活体检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测骨质疏松症的生物标志物、其可激活式的近红外荧光探针的制备方法及应用。本发明专利技术提供的生物标志物与多种原发骨质疏松症呈负相关性。其可激活式近红外探针包括荧光链、淬灭链、燃料链。具体制备方法包括如下步骤：将Cy5标记DNA荧光链(F

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CKIP-1的用于检测骨质疏松症的荧光探针及其在活体检测中的应用


[0001]本专利技术涉及一种检测骨质疏松症的生物标志物CKIP-1、及其可激活式近红外荧光探针的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种以骨量下降和骨微结构恶化为特征的骨骼退行性疾病，最终导致骨骼脆弱性和骨折风险增加。它的发生是由于骨重塑紊乱，而骨重塑又主要受骨形成和骨吸收的调节。骨质疏松症包括两种类型：原发性(I型：绝经后，II型：老年)和继发性(如先天性疾病、药物和失重/停用)。由于其高发病率和死亡率，已成为世界范围内的重大公共卫生问题。据估计到2020年，美国的骨质疏松症患者数量将从大约1000万增加到1400多万；在中国，40-49岁人群中骨质疏松症患病率为3.2％，50岁以上人群为19.2％，65岁以上人群为32.0％。此外，骨质疏松性骨折最严重的为髋部骨折，且正在呈逐年增加。世界卫生组织(WHO)预测，2025年全球髋部骨折数量将达到260万，2050年将达到450万。骨质疏松患者髋部骨折的终生风险高达40％，与冠心病相当。足可见其危害性及严重性，随之带来的巨大社会医疗经济负担。OP也被认为是一种“无声的流行病”，因为它通常在骨折住院患者中才得到初步诊断。虽然OP目前仍无法治愈，但早期诊断和治疗后的随访有助于减缓其发展进程。
[0003]目前，临床骨质疏松症主要依靠双能X线骨密度仪(DXA)或定量CT(QCT)成像技术来测量骨密度或骨骼微结构，是临床判断骨质疏松症的金标准。基于光学成像的分子探针作为临床检测手段的重要补充，其本身没有辐射暴露问题，可以实现体内无创或微创成像效果。它能以体内特定分子作为荧光成像的靶点，在细胞或分子水平上直接显示生理和病理过程，从而达到疾病检测和诊断的目的。
[0004]近红外荧光(NIR)日益成为体内荧光成像的首选工具，因为近红外发射波长为650-900nm，这为荧光探针提供了高的组织穿透性，并避免了组织的自发荧光。近红外成像的这种优势使其能够更多的应用于临床，特别是在肿瘤学研究和外科指导。
[0005]然而，到目前为止，只有几个基于NIR的应用被开发来监测骨重塑活动的探针。一种选择是将近红外荧光团(如IRDye78、IRDye800CW、indocyanine green)与具有骨的高结合亲和力的物质(如二磷酸盐和四环素)结合的探针。探针发展的另一个方向是利用具有催化活性的组织特异性酶的活化策略。最近，开发了一种利用Cathepsin K可分裂序列的可激活探针。在Cathepsin K存在的情况下，该探针从原本淬灭形式变成荧光，这使得它对骨吸收的变化敏感这些探针只能监测骨形成或骨吸收活动，不能监测活体动物的骨密度或骨质疏松状态。也就是说缺乏可靶标的生物标志物或指标，使得基于NIR的荧光成像技术在动态骨重塑中面临挑战。因此，深入挖掘有效的骨代谢或骨质疏松标志物势在必行，如何激活和捕获靶点的荧光信号也待解决，特别是对于低丰度的靶点或生物标志物。
[0006]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]第一方面，本专利技术提供了一种可用于检测骨质疏松症的生物标志物，其特征在于，所述标志物为酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1(CKIP-1)，其与骨质疏松症呈负相关性。
[0008]第二方面，本专利技术提供了一种基于上述生物标志物的近红外荧光探针，其特征在于，所述探针可特异性识别CKIP-1mRNA序列。
[0009]本专利技术提供的近红外荧光探针，其特征在于，所述探针由带有荧光标记的DNA荧光链F-DNA、带有淬灭基团的DNA淬灭链Q-DNA和杂交连接DNA链Linker DNA组成的双链结构，见图1；Linker DNA上具有第一结合区域和第二结合区域，其中第二结合区域与F-DNA的临近荧光基团部分序列互补，第一结合区域与待检测靶标部分或完全互补。
[0010]当不存在待检测靶标时，荧光标记和猝灭基团临近，不发光。
[0011]当存在待检测靶标时，Linker DNA能够优先与靶标序列互补结合，释放F-DNA，发出荧光。
[0012]进一步地，第一结合区域比第二结合区域长，使得当存在待检测靶标时，Linker DNA能够优先与靶标互补，释放F-DNA。
[0013]进一步地，探针还包括燃料链，所述燃料链与Linker DNA部分互补，且互补区域包括第二结合区域互补。
[0014]进一步地，燃料链与Linker DNA互补区域长于待检测靶标与Linker DNA互补区域，使得燃料链能够与第二结合区域互补结合，释放Q-DNA和待检测靶标。
[0015]进一步地，荧光标记可选用Cy5，还可选用IRDye78、IRDye800CW、indocyanine green等荧光标记。当荧光标记为Cy5时，可选用猝灭基团BHQ3。
[0016]进一步地，探针还包括燃料链，所述燃料链与Linker DNA部分互补，且互补区域包括第二结合区域。
[0017]更进一步地，燃料链与Linker DNA互补区域长于待检测靶标与Linker DNA互补区域，使得燃料链能够与第二结合区域互补结合，释放Q-DNA和待检测靶标。
[0018]本专利技术提供的近红外荧光探针，其特征在于，Cy5标记DNA荧光链F-DNA为SEQ ID NO:1所示序列，BHQ3标记DNA淬灭链Q-DNA为SEQ ID NO:2所示序列，杂交连接DNA链Linker DNA为SEQ ID NO:3所示序列，燃料链DNA为SEQ ID NO:4所示序列。
[0019]本专利技术提供的近红外荧光探针，其制备方法包括以下步骤：将F-DNA链、Q-DNA链和Linker DNA链混合，反应，即得。
[0020]基于CKIP-1的近红外荧光探针的制备方法具体如下：
[0021](1)将F-DNA链、Q-DNA链和Linker DNA链以1:2:2比例混合，95℃孵育5分钟，然后以0.1℃/s梯度降温至37℃；
[0022](2)待步骤(1)所述反应结束后，将所得探针进一步与燃料链DNA混合，与3000(Thermo Fisher Scientific,USA)室温孵育30min；探针与燃料链DNA的摩尔比为1:5。
[0023](3)步骤(2)反应结束后，即得近红外荧光探针。
[0024]第三方面，本专利技术提供一种近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，将上述Linker DNA链、Q-DNA链和F-DNA链以合适比例混合，反应，即得。
[0025]进一步地，所述反应的具体条件为：90-98℃孵育10分钟，然后以梯度降温至37℃；
反应结束后，将所得探针进一步与燃料链DNA混合，于室温孵育30min。
[0026]更进一步地，所述反应的具体条件为：95℃孵育5分钟，然后以0.1℃/s梯度降温至37℃；反应结束后，将所得探针进一步与燃料链DNA混合，于室温孵育30min；探针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测骨质疏松症的生物标志物的方法，其特征在于，所述标志物为酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1，CKIP-1，其与骨质疏松症呈负相关性。2.一种靶向CKIP-1的用于检测骨质疏松症的近红外荧光探针，其特征在于，所述探针可特异性识别CKIP-1mRNA序列。3.如权利要求2所述的近红外荧光探针，其特征在于，所述探针由带有荧光标记的DNA荧光链F-DNA、带有淬灭基团的DNA淬灭链Q-DNA和杂交连接DNA链Linker DNA组成的双链结构；Linker DNA上具有第一结合区域和第二结合区域，其中第二结合区域与F-DNA的临近荧光标记部分序列互补，第一结合区域与待检测靶标部分或完全互补；当不存在待检测靶标时，荧光标记和猝灭基团临近，不发光；当存在待检测靶标时，Linker DNA能够优先与靶标序列互补结合，释放F-DNA，发出荧光。4.如权利要求3所述的近红外荧光探针，其特征在于，探针还包括燃料链，所述燃料链与Linker DNA部分互补，且互补区域包括第二结合区域；所述燃料链与Linker DNA互补区域长于待检测靶标与Linker DNA互补区域，使得燃料链能够与第二结合区域互补结合，释放Q-DNA和待检测靶标。5.如权利要求3或4所述的近红外荧光探针，荧光标记为Cy5，猝灭基团为BHQ3；荧光标记基团还可以是IRDye78、IRDye800CW、indocyanine green。6.如权利要求5所述的近红外荧光探针，其特征在于，Cy5标记DNA荧光链F-DNA为SEQ ID NO:1所示序列，BHQ3标记DNA淬灭链Q-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张令强，崔宇，杨曦，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：