GntR家族转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B制造技术

本发明专利技术公开了一种GntR家族转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用。其中所述突变体的氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列存在下述突变：第89位氨基酸替换为M。对枯草芽孢杆菌染色体上的GntR家族转录抑制因子基因中第89位氨基酸编码核苷酸进行定点突变而编码氨基酸M，而获得的基因工程菌，其生产维生素B2的能力得到了较大幅度的提升，并且对菌的生长有利，因而具有较大的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
GntR家族转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用
：本专利技术属于生物
，具体涉及GntR家族转录抑制因子的突变体，其基因工程菌，以及在制备维生素B2中的应用。
技术介绍
：核黄素(Riboflavin)又称维生素B2，分子式为C17H20O6N4，是维生素B族中的一种水溶性维生素，在生物体内以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)两种形式存在，作为机体内一些重要的氧化还原酶的辅酶参与氧化还原反应，起到递氢的作用。核黄素的缺乏会导致生物体代谢发生障碍，但人和动物均不能自身合成，只能从食物中摄取，因此核黄素的生产在食品、饲料以及医药行业都具有非常广阔的市场。目前核黄素的工业生产方法有植物萃取法、化学合成法、半合成法以及微生物合成法。其中，微生物合成法以其成本低、环境友好以及能源可再生等优点逐步占据主导地位，成为大部分工业化生产的主要方法。在众多可生产核黄素的微生物中，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)作为一种非病原微生物，生理代谢及遗传背景清楚，便于确定代谢靶点及基因工程改造，并具有可靠的安全性，它们的发酵产物在食品与饲料业中已有长期的应用，对环境、医药和工业发酵生产都非常重要。其次枯草芽孢杆菌基因工程菌株能够过量合成叶酸、肌苷或鸟苷，具有为核黄素过量合成提供足够前体物的潜力，因此枯草芽孢杆菌基因工程菌在核黄素的微生物发酵生产中逐渐显示出了强大的生命力，成为主要生产菌株。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中核黄素的合成需要5-磷酸核酮糖(Ru5P)和鸟嘌呤-5’-三磷酸(GTP)两个前体物质，其中Ru5P来源于磷酸戊糖途径，GTP来源于嘌呤的从头合成途径。二者在一些列核黄素操纵子的作用下经7步反应由核黄素合成途径最终合成核黄素。GntR家族为葡萄糖酸操纵子转录抑制因子(Gluconateoperontranscriptionalrepressor,GntR)，首次在枯草芽孢杆菌中发现，是原核生物中广泛存在的转录因子(transcriptionfactors,TFs)家族之一(FujitaY,FujitaT,MiwaY,etal.Organizationandtranscriptionofthegluconateoperon,gnt,ofBacillussubtilis.[J].TheJournalofbiologicalchemistry,1986,261(29):13744-13753)。GntR家族成员可调节代谢途径、形态形成、孢子形成、细胞包膜应激反应或次生代谢产物如抗生素的产生等多种生物过程(RigaliS,DerouauxA,GiannottaF,etal.Subdivisionofthehelix-turn-helixGntRfamilyofbacterialregulatorsintheFadR,HutC,MocR,andYtrAsubfamilies.[J].TheJournalofbiologicalchemistry,2002,277(15):12507-12515)。YtrA是一个由枯草芽孢杆菌YtrATF原型化的GntR亚家族，整个操纵子包括ytrA、ytrB、ytrC、ytrD、ytrE和ytrF，该家族中第一个基因(ytrA)编码ytr操纵子的负调控因子，随后的五个基因编码ABC转运蛋白(YoshidaKI,FujitaY,EhrlichSD.AnoperonforaputativeATP-bindingcassettetransportsysteminvolvedinacetoinutilizationofBacillussubtilis.[J].Journalofbacteriology,2000,182(19):5454-5461)。YtrA是细胞膜应激反应的额外调节器，除可调节细胞壁对抗生素的应激反应外，还可以调节乙偶姻的利用(SalzbergLI,LuoY,HachmannAnna-Barbara,etal.TheBacillussubtilisGntRfamilyrepressorYtrArespondstocellwallantibiotics.[J].Journalofbacteriology,2011,193(20):5793-5801)。乙偶姻的产生会消耗EMP途径中间代谢物，增强与磷酸戊糖途径的竞争，进而减少维生素B2前体物质的合成。另外，调控基因ytrA的转录表达水平可在一定程度上有助于菌株的生长，进而提高所需目标物的产量。目前，尚未有GntR家族转录抑制因子突变基因ytrA用于维生素B2合成的报道。
技术实现思路
：本专利技术人前期筛选出了一株高产维生素B2的枯草芽孢杆菌CGMCCNO.16132菌株(见中国专利申请201910604170.3)，可发酵生产维生素B2。本专利技术作了进一步研究以发现对产维生素B2能力有影响的基因。经过研究发现一种GntR家族转录抑制因子编码基因的突变，通过验证在枯草芽孢杆菌中将GntR家族转录抑制因子编码基因点突变为所述突变基因则能够提高所述菌生产维生素B2的能力。首先，本专利技术提供一种GntR家族转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列在SEQIDNo.3所示原始序列的基础上具有下述突变：第26位氨基酸替换为H。优选地，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。其次，本专利技术提供所述的GntR家族转录抑制因子的突变体的编码基因。优选地，所述核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。相应地，本专利技术第三方面还提供含有所述GntR家族转录抑制因子的突变体的编码基因的表达盒、重组载体。所述重组载体对出发载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体包括但不限于质粒，噬菌体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。更优选地是重组表达载体，更优选原核重表达载体。最优选是适合于在枯草芽孢杆菌中进行表达的表达载体。第四方面，本专利技术提供含有所述GntR家族转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。其中所述“宿主细胞”是具有本领域通常理解的含义，其能够导入本专利技术的突变体的编码基因的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。本专利技术的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选为原核细胞，更优选为枯草芽孢杆菌。第五方面，本专利技术提供GntR家族转录抑制因子突变体编码基因在制备维生素B2中的应用。第六方面，本专利技术提供一种增强枯草芽孢杆菌产维生素B2的方法，其是将染色体上的GntR家族转录抑制因子编码基因进行定点突变，获得产维生素B2的能力增强的枯草芽孢杆菌，其中所述定点突变是将所述编码基因的第89位氨基酸编码核苷酸替换为编码氨基酸M编码核苷酸，更具体的是所述编码基因的第266位核苷酸由C置换了T。其中的定点突变可以采用本领域已知的各种方法来实现。优选地，所述枯草芽孢杆菌的原始菌株是枯草芽孢杆菌BS168ribCm的菌株。本专利技术第七方面，提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种GntR家族转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于SEQID No.3所示序列仅存在下述突变：第89位氨基酸替换为M。/n

【技术特征摘要】
1.一种GntR家族转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于SEQIDNo.3所示序列仅存在下述突变：第89位氨基酸替换为M。


2.如权利要求1所述的GntR家族转录抑制因子的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。


3.如权利要求1所述的GntR家族转录抑制因子的突变体的编码基因。


4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


5.含有权利要求3所述的GntR家族转录抑制因子的突变体的编码基因的重组载体。


6.含有权利要求3所述的GntR家族转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，孙宜文，刘川，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12