提高蛋白表达量的信号肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了提高蛋白表达量的信号肽及其应用，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明专利技术以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达宿主，将枯草芽孢杆菌内源信号肽Bp、NprB、YdjM分别融合至普鲁兰酶基因的N端，并将这3种信号肽进行同义突变，经发酵后选择最有利于普鲁兰酶表达的同义突变核苷酸序列，所得到的突变后的3种信号肽序列，可使普鲁兰酶胞外酶活分别提高至改造前的4.15，2.33，1.67倍，有利于提高普鲁兰酶的胞外表达，有利于规模化生产普鲁兰酶。

【技术实现步骤摘要】
提高蛋白表达量的信号肽及其应用
本专利技术涉及提高蛋白表达量的信号肽及其应用，属于基因工程及酶工程

技术介绍
普鲁兰酶能够专一性水解支链淀粉的分支，在淀粉糖化工艺中，常与葡糖淀粉酶或β-淀粉酶联用，生产葡萄糖浆和麦芽糖浆。因此在多种工业领域(如食品、药物中间体及饲用酶制剂等)中，都得到了广泛的应用，是生产工艺中保障高效生产和经济效益的重要法宝。随着DNA重组技术的迅速发展，大量研究采用基因工程菌来表达普鲁兰酶，以期走出野生菌普鲁兰酶产量低下的困境。枯草芽孢杆菌具有无致病性、且结构简单、有利于蛋白质的跨膜分泌过程等特点；此外，其还有无明显的密码子偏好性、具有很强的蛋白分泌能力；因而被广泛应用于基因工程技术中，用以表达蛋白。虽然前期也有通过改造普鲁兰酶本身的氨基酸组成、或利用一些信号肽诱导蛋白的表达，来提升普鲁兰酶胞外表达的活力；但是对酶本身的氨基酸组成发生改变常常会导致酶本身的催化性能受到影响，而利用信号肽虽然使得蛋白的表达量得到了提升，但普鲁兰酶的表达量依旧无法满足工业化大规模生产的需求。因而，需要寻找一种将普鲁兰酶胞外表达量得到进一步提升的同时，又不改变酶本身性能的方法，以适应普鲁兰酶规模化生产的需求。
技术实现思路
为解决目前存在的问题，本专利技术通过对信号肽N端编码区(NCS)进行同义突变，在确保蛋白翻译不受影响的情况，筛选出能显著提高蛋白表达量的信号肽，为蛋白的高效表达提供了一种新方法。本专利技术提供了一类信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示任一。本专利技术提供一种提高枯草芽孢杆菌胞外蛋白表达量的方法，在编码蛋白的核苷酸序列的N端添加核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的信号肽。在本专利技术的一种实施方式中，在目的蛋白的N端添加核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的信号肽，并构建重组质粒，将重组质粒导入枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，将核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的信号肽添加至编码目的蛋白的核苷酸序列的起始密码子ATG后。在本专利技术的一种实施方式中，所述目的蛋白为普鲁兰酶和/或sfGFP。在本专利技术的一种实施方式中，所述普鲁兰酶氨基酸序列的NCBI登录号为AMQ67157，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述sfGFP的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术提供了含有核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的信号肽的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒上含有组成型或诱导型启动子。在本专利技术的一种实施方式中，所述组成型或诱导型启动子为能够在枯草芽孢杆菌中表达的启动子。在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子包括LytR启动子，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒以任意能在枯草芽孢杆菌中表达的表达质粒为出发载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述出发载体包括P43NMK。本专利技术提供了含有核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的信号肽，或含有所述重组质粒的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括但不限于枯草芽孢杆菌WB600和/或枯草芽孢杆菌168。本专利技术提供一种提高蛋白表达量的方法，利用所述含有核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的重组菌发酵生产蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，将所述重组菌在种子培养基中培养至为OD600不低于3.0的菌液，再将该菌液以1～10mL/100mL的接种量接种至反应体系中。在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系中的组分包括蛋白胨5～20g/L，酵母提取物20～30g/L，甘油1～5mL/L，KH2PO40.01～0.02mol/L，K2HPO40.6～0.8mol/L。在本专利技术的一种实施方式中，在30～40℃、200～250rpm发酵20～40小时。本专利技术还保护所述核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的信号肽，或所述含有核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的重组质粒在提高胞外蛋白表达量中的应用。本专利技术还保护所述含有核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的信号肽的宿主细胞在提高胞外蛋白表达量中的应用。本专利技术还保护提高蛋白表达量的方法，或提高枯草芽孢杆菌胞外蛋白表达量的方法在提高胞外蛋白表达量中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过同义突变信号肽所得的核苷酸序列，融合在普鲁兰酶的N端，普鲁兰酶的胞外酶活分别提高4.15，1.67，2.33倍。附图说明图1为信号肽Bpr和sfGFP分别融合在普鲁兰酶N端和C端的表达质粒图谱。图2为信号肽Bpr融合在普鲁兰酶N端的表达质粒图谱。图3为野生型与NCS改造菌株分泌的普鲁兰酶胞外酶活。具体实施方式1、培养基LB种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。TB发酵培养基(g/L)：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL；各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL灭菌的0.17mol/L的KH2PO4、0.72mol/L的K2HPO4溶液(2.31g的K2HPO4和12.54g的K2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL；0.22μm的滤膜过滤除菌)。2、培养方法种子培养：挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h。发酵培养：按4mL/100mL的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，发酵48h。3、绿色荧光蛋白表达量及生物量测定在96孔板中假如200μL稀释后的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，绿色荧光激发波长：480nm，绿色荧光发射波长：520nm，细胞生长OD吸收波长：600nm。4、普鲁兰酶酶活测定方法将1mL1mg/100mL的普鲁兰多糖底物和0.9mL100mMpH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液混合均匀，置于60℃水浴锅内预热10min，加入普鲁兰酶液0.1mL，反应10min后，加入3mLDNS显色液，然后于沸水浴中煮7min，置于冰水中终止显色反应，再加10mL去离子水，混匀，在540nm下测定吸光值。单位时间内生成1μmol还原糖的酶量定义为一个酶活力单位。5、使用的试剂一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。实施例1：构建Bpr信号肽NCS同义突变文库将LytR启动子(核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)通过连接至P43NMK质粒，构建得到重组质粒，将重组质粒转入E.coliJM109中，将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃培养至长出单克隆，挑取单克隆测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.信号肽，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3任一所示。/n

【技术特征摘要】
1.信号肽，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1～3任一所示。


2.一种提高枯草芽孢杆菌胞外蛋白表达量的方法，其特征在于，向编码蛋白的核苷酸序列的N端添加权利要求1所述信号肽。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在蛋白的N端添加权利要求1所述信号肽，获得编码重组蛋白的基因；
(2)构建表达步骤(1)所述基因的重组质粒，再将构建的重组质粒导入枯草芽孢杆菌。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括普鲁兰酶和/或sfGFP。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述普鲁兰酶的NCBI登录号为AMQ67157。


6.一种重组质粒，其特征在于，连接有...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟毅，刘松，徐奎栋，李江华，陈坚，
申请(专利权)人：吉林中粮生化有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22