核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B

【技术实现步骤摘要】
核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体，其基因工程菌以及在维生素B2中的应用。
技术介绍
核黄素又名维生素B2，是一种水溶性B族维生素，大多数微生物和植物可自主合成，而人和动物只能从食物中摄取。核黄素在生物体内主要以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式存在，它作为黄素蛋白的辅酶或辅基参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应，是维持机体正常代谢和生理功能所必需的营养素。核黄素被广泛应用于医药、食品和饲料等领域，由于核黄素的广泛用途，国内外对核黄素的需求量仍呈现日益增加的趋势。微生物发酵是工业化生产核黄素的主要方法，具有成本低、环境污染小、生产周期短、产品纯度较高等优点。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）具有可靠的生物安全性，这对环境、医药和工业发酵生产都非常重要。传统诱变育种发现，枯草芽孢杆菌突变株能够过量合成叶酸、肌苷或鸟苷，具有为核黄素过量合成提供足够前体物的潜力。枯草芽孢杆菌作为重要的模式菌，相关的基因工程技术和遗传转化方法都比较成熟，有利于通过理性代谢工程及系统生物学手段选育核黄素高产菌株。在枯草芽孢杆菌中，需要经过由磷酸戊糖途径、嘌呤合成途径、核黄素合成途径催化的二十多步反应才能将葡萄糖转化为核黄素。合成核黄素的两个直接前体5-磷酸核酮糖和GTP分别由磷酸戊糖途径和嘌呤合成途径产生，最终5-磷酸核酮糖和GTP在核黄素操纵子编码的酶的催化下经过7歩反应生成核黄素。核糖核苷酸还原酶（ribonucleosidereductase,RNR）是微生物合成脱氧核糖核苷酸的关键酶。在枯草芽孢杆菌中，nrdE、nrdF基因编码的核糖核苷酸还原酶的表达受到转录调控因子NrdR的调控。除枯草芽孢杆菌外的多种微生物中，NrdR的同源蛋白都调控着RNR的表达，因而NrdR在微生物的生长中起着重要的作用（CaseEDR,AkersJC,TanM.CT406EncodesaChlamydialOrthologofNrdR,aRepressorofRibonucleotideReductase[J].JournalofBacteriology,2011,193(17)：4396-4404）。近年来研究者们发现，NrdR的作用不仅是调控着RNR的表达，它也在微生物的致病性、移动性、耐药性中发挥作用（DreuxN,CendraMDM,Massier,Sébastien,etal.RibonucleotideReductaseNrdRasaNovelRegulatorforMotilityandChemotaxisduringAdherent-InvasiveEscherichiacoliInfection[J].InfectionandImmunity,2015,83(4)：1305-1317）。此外在菌株中敲除和过表达nrdR基因后均引起组学水平上的基因表达变化（NaveenV,HsiaoCD.NrdRTranscriptionRegulation：GlobalProteomeAnalysisandItsRoleinEscherichiacoliViabilityandVirulence[J].PLOSONE,2016,11(6)：e0157165），因而认为NrdR也是一种全局性的转录调控因子。缺失nrdR（ytcG）基因的菌株中嘌呤合成途径的若干基因与野生型相比转录水平发生了明显的变化（Viridiana,Castro-Cerritos,Karla,etal.LC-MS/MSproteomicanalysisofstarvedBacillussubtiliscellsoverexpressingribonucleotidereductase(nrdEF)：implicationsinstress-associatedmutagenesis[J].CurrentGeneticsEukaryoteswithEmphasisonYeastsFungiMitochondriaPlastids,2018.64：215-222)，而嘌呤合成途径是合成核黄素的重要前体物质GTP的合成途径，因此，nrdR的表达水平与核黄素的合成量具有一定的潜在联系。目前，尚未有核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变基因nrdR（ytcG）用于维生素B2合成的报道。
技术实现思路
本专利技术人前期筛选出了一株高产维生素B2的枯草芽孢杆菌CGMCCNO.16132菌株（见中国专利申请201910604170.3），可发酵生产维生素B2。本专利技术人对其作了进一步研究以发现对产维生素B2能力有影响的基因。经过研究发现一种突变的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因，通过验证在枯草芽孢杆菌中将核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因定点突变为所述突变基因则能提高所述菌生产维生素B2的能力。因此，本专利技术首先提供一种核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体，其多肽氨基酸序列相对于SEQIDNo.3所示序列存在下述突变：第26位氨基酸替换为H。优选地，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。其次，本专利技术提供上述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因。优选地，所述核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。相应地，本专利技术第三方面还提供含有所述核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因的表达盒、重组载体。所述重组载体对出发载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体包括但不限于质粒，噬菌体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。更优选地是重组表达载体，更优选原核重表达载体。最优选是适合于在枯草芽孢杆菌中进行表达的表达载体。第四方面，本专利技术提供含有所述核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。其中所述“宿主细胞”是具有本领域通常理解的含义，其能够导入本专利技术的突变体的编码基因的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。本专利技术的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选为原核细胞，更优选为枯草芽孢杆菌。第五方面，本专利技术提供核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变体、或其编码基因在制备维生素B2中的应用。第六方面，本专利技术提供一种增强枯草芽孢杆菌产维生素B2的方法，其是将染色体上的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因进行定点突变，获得产维生素B2的能力增强的枯草芽孢杆菌，其中所述定点突变是将所述编码基因的第26位氨基酸的编码核苷酸定点突变以编码H，更具体的，所述编码基因的第77位核苷酸由A置换了G。其中的定点突变可以采用本领域已知的各种方法来实现。优选地，所述枯草芽孢杆菌的原始出发菌株是枯草芽孢杆菌BS168ribCm的菌株。本专利技术第六方面，提供一种利用上述第五方面的方法获得的枯草芽孢杆菌制备维生素B2的方法，其包括培养所述枯草芽孢杆菌，以及收集维生素B2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第26位氨基酸替换为H。/n

【技术特征摘要】
1.一种核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于SEQIDNo.3所示序列仅存在下述突变：第26位氨基酸替换为H。


2.如权利要求1所述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。


3.如权利要求1所述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因。


4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


5.含有权利要求3所述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因的重组载体。


6.含有权利要求3所述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，夏苗苗，刘川，孙宜文，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12