过氧化物转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种过氧化物转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B

【技术实现步骤摘要】
过氧化物转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及过氧化物转录抑制因子的突变体，其基因工程菌，以及在制备维生素B2中的应用。
技术介绍
核黄素（Riboflavin）又称维生素B2，分子式为C17H20O6N4，是维生素B族中的一种水溶性维生素，在生物体内以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）两种形式存在，作为机体内一些重要的氧化还原酶的辅酶参与氧化还原反应，起到递氢的作用。核黄素的缺乏会导致生物体代谢发生障碍，但人和动物均不能自身合成，只能从食物中摄取，因此核黄素的生产在食品、饲料以及医药行业都具有非常广阔的市场。目前核黄素的工业生产方法有植物萃取法、化学合成法、半合成法以及微生物合成法。其中，微生物合成法以其成本低、环境友好以及能源可再生等优点逐步占据主导地位，成为大部分工业化生产的主要方法。在众多可生产核黄素的微生物中，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）作为一种非病原微生物，生理代谢及遗传背景清楚，便于确定代谢靶点及基因工程改造，并具有可靠的安全性，它们的发酵产物在食品与饲料业中已有长期的应用，对环境、医药和工业发酵生产都非常重要。其次枯草芽孢杆菌基因工程菌株能够过量合成叶酸、肌苷或鸟苷，具有为核黄素过量合成提供足够前体物的潜力，因此枯草芽孢杆菌基因工程菌在核黄素的微生物发酵生产中逐渐显示出了强大的生命力，成为主要生产菌株。枯草芽孢杆菌（B.subtilis）中核黄素的合成需要5-磷酸核酮糖（Ru5P）和鸟嘌呤-5’-三磷酸（GTP）两个前体物质，其中Ru5P来源于磷酸戊糖途径，GTP来源于嘌呤的从头合成途径。最终5-磷酸核酮糖和GTP在核黄素操纵子编码的酶的催化下经过7步反应生成核黄素。过氧化物转录抑制因子（PerR）主要存在于革兰氏阳性细菌中，其功能为控制抗氧化基因的表达（WangX,TongH,DongX.PerR-regulatedmanganeseionuptakecontributestooxidativestressdefenseinanoralstreptococcus.[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,2014,80(8):2351-2359.），是许多细菌中过氧化物胁迫防御的主要调节剂。在有氧代谢过程中过氧化物的感应对细胞存活尤为重要，在氧化条件的刺激下PerR会在体内降解（AhnBo-Eun,BakerTaniaA.Oxidizationwithoutsubstrateunfoldingtriggersproteolysisoftheperoxide-sensor,PerR.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2016,113(1):23-31.）。细菌通过控制胞内PerR的表达水平来调控过氧化物抵御因子基因的表达，以此种方式应对过氧化物胁迫压力。在枯草芽孢杆菌中，PerR主要作用方式是经由过氧化物的胁迫来改变蛋白构象，进而调节过氧化物抗性基因（KebouchiM,SaulF,TaherR,etal.StructureandfunctionoftheLeptospirainterrogansperoxidestressregulator(PerR),anatypicalPerRdevoidofastructuralmetal-bindingsite.[J].TheJournalofbiologicalchemistry,2018,293(2):497-509.），其编码基因perR的转录水平并不受过氧化氢的影响，编码过氧化氢酶（KatA）、烷基过氧化氢还原酶（AhpC和F）以及铁储存蛋白（MrgA）的基因都由PerR调控（LilliamC,AdamD,BarbaraS,etal.Lackofasigni¢cantroleforthePerRregulatorinBacillussubtilissporeresistance.[J].FEMSMicrobiologyLetters,2000,188:203-208.）。调控基因perR的转录表达水平可以在一定程度上有助于菌株的生长，进而提高所需目标物的产量。目前，尚未有过氧化物转录抑制因子突变基因perR用于维生素B2合成的报道。
技术实现思路
本专利技术人前期筛选出了一株高产维生素B2的枯草芽孢杆菌CGMCCNO.16132菌株（见中国专利申请201910604170.3），可发酵生产维生素B2。本专利技术人对其作了进一步研究以发现对产维生素B2能力有影响的基因。经过研究发现一种过氧化物转录抑制因子编码基因的突变，通过验证在枯草芽孢杆菌中将过氧化物转录抑制因子编码基因定点突变为所述突变基因则能够提高所述菌生产维生素B2的能力。首先，本专利技术提供一种过氧化物转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列在SEQIDNo.3所示原始序列的基础上存在下述突变：第71位氨基酸替换为V。优选地，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。其次，本专利技术提供所述的过氧化物转录抑制因子的突变体的编码基因。优选地，所述核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。相应地，本专利技术第三方面还提供含有所述过氧化物转录抑制因子的突变体的编码基因的表达盒、重组载体。所述重组载体对出发载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体包括但不限于质粒，噬菌体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。更优选地是重组表达载体，更优选原核重组表达载体。最优选是适合于在枯草芽孢杆菌中进行表达的表达载体。第四方面，本专利技术提供含有所述过氧化物转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。其中所述“宿主细胞”是具有本领域通常理解的含义，其能够导入本专利技术的突变体的编码基因的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。本专利技术的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选为原核细胞，更优选为枯草芽孢杆菌。第五方面，本专利技术提供过氧化物转录抑制因子突变体编码基因在制备维生素B2中的应用。第六方面，本专利技术提供一种增强枯草芽孢杆菌产维生素B2的方法，其是将染色体上的过氧化物转录抑制因子编码基因进行定点突变，获得产维生素B2的能力增强的枯草芽孢杆菌，其中所述定点突变是将所述编码基因的第71位氨基酸编码核苷酸替换为编码氨基酸V编码核苷酸，更具体的是所述编码基因的第211位核苷酸由G置换了T。其中的定点突变可以采用本领域已知的各种方法来实现。优选地，所述枯草芽孢杆菌的原始菌株是枯草芽孢杆菌BS168ribCm的菌株。本专利技术第六方面，提供一种利用上述第五方面的方法获得的枯草芽孢杆菌制备维生素B2的方法，其包括培养所述枯草芽孢杆菌，以及收集维生素B2的步骤，更优选还包括纯化维生素B2的步骤。其中枯草芽孢杆菌的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种过氧化物转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于SEQID No.3所示序列仅存在下述突变：第71位氨基酸替换为V。/n

【技术特征摘要】
1.一种过氧化物转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于SEQIDNo.3所示序列仅存在下述突变：第71位氨基酸替换为V。


2.如权利要求1所述的过氧化物转录抑制因子的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。


3.如权利要求1所述的过氧化物转录抑制因子的突变体的编码基因。


4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


5.含有权利要求3所述的过氧化物转录抑制因子的突变体的编码基因的重组载体。


6.含有权利要求3所述的过氧化物转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，孙宜文，夏苗苗，刘川，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12