一种牛支原体分泌性黏附蛋白MbovP581制造技术

本发明专利技术属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一种牛支原体分泌性黏附蛋白MbovP58。该蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。根据大肠杆菌密码子偏爱性，将Mbov_0581基因进行突变，突变后的序列如SEQ ID NO:3所示。用免疫转印法证实该蛋白为分泌蛋白，能与感染牛血清反应。用免疫荧光试验和流式细胞术检测大肠杆菌表达的重组蛋白rMbovP581对牛肺上皮细胞(EBL)的黏附，发现MbovP581对EBL细胞具有良好的黏附能力。综合该蛋白的分泌特征、免疫原性和黏附性，该蛋白可望在制备牛支原体诊断试剂、药物和疫苗中应用。

【技术实现步骤摘要】
一种牛支原体分泌性黏附蛋白MbovP581
本专利技术属于动物传染病防治
，具体涉及一种牛支原体分泌性黏蛋白MbovP581。
技术介绍
牛支原体(Mycoplasmabovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，能引起肉牛和奶牛肺炎、乳腺炎、关节炎等重要疾病，还可导致生殖道炎症、结膜炎、中耳炎等多种症状，平均发病率为40％，病死率为10％。牛支原体于1961年首次在美国从患乳房炎奶牛的牛奶中分离得到，1976年证实其是导致肺炎的重要病原体。2008年，湖北省从外地引进肉牛中流行呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重，华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室率先确定该病为“传染性牛支原体肺炎”，此后，发现该病已在全国普遍流行。架子牛的牛支原体肺炎发病往往与肉牛异地育的运输应激有关，而初生犊牛可通过吮吸患牛支原体乳腺炎母牛的母乳而被感染，发生牛支原体肺炎、关节炎和耳炎(郭爱珍，2011)。当牛支原体肺炎发生后，又进一步导致牛体免疫力下降，导致其他条件致病菌如A型多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、呼吸道合胞体病毒等继发感染，协同致病，加重临床症状，统称为牛呼吸疾病综合征(Bovinerespiratorydiseases,BRD)。该病呈世界性流行。在法国，其患有肺炎的牛场中牛支原体的分离率30％；在不列颠，其患有肺炎的牛场中牛支原体抗体阳性率为20％-25％；在爱尔兰，其患有肺炎的牛场中牛支原体的分离率为13％-23％。新西兰于2017年7月首次报道奶牛感染牛支原体，此后数月多个农场受到影响，数万头奶牛被捕杀。该国政府正在通过大规模捕杀来实施根除计划，试图成为世界上第一个消灭牛支原体的国家。目前尚缺乏特异性防控手段用于牛支原体病的防治，而创制特异性防控措施需要特异性分子靶标。确定牛支原体的毒力相关因子和免疫原性蛋白是发现牛支原体特异性靶标的前提。分泌蛋白常与病原体毒力和免疫反应相关，因此是寻找特异性分子靶标的优先考虑对象。然而，由于牛支原体基因组中大部分基因为未知基因，且支原体分泌蛋白的研究刚起步，所以，相关研究进展缓慢。本申请人通过双向电泳与质谱分析鉴定出MbovP581蛋白存在于牛支原体分泌蛋白组中，具有免疫原性。进一步证明该分泌蛋白是牛支原体的一种细胞黏附蛋白。鉴于黏附是感染发生的第一步，因此该蛋白是一种很有前途的分子靶标。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牛支原体分泌性黏附蛋白MbovP581，该蛋白基因可望作为牛原体的特异性分子靶标，可用于研发牛支原体病特异性的防控。本专利技术的技术方案如下所述：申请人通过免疫荧光方法发现该蛋白可以黏附牛肺上皮细胞。申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801，MycoplasmabovisHB0801,于2010年2月1日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2010040。使用三氯醋酸(TCA)丙酮沉淀法提取牛支原体HB0801株分泌蛋白组，利用双向电泳的裂解缓冲液溶解分泌蛋白组，通过常规Westernblot方法，证明该蛋白为一种分泌蛋白。以HB0801基因组为模板，克隆Mbov_0581基因，将基因按照大肠杆菌密码子偏爱性进行修饰，表达和纯化重组rMbovP581。将该蛋白与牛肺上皮细胞(Embryonicbovinelungcells，EBL)进行孵育，通过免疫荧光方法检测并证实rMbovP581蛋白能特异性地黏附到EBL细胞上，确认是牛支原体的一种黏附蛋白。本专利技术具有以下优点：本专利技术首次发现牛支原体分泌蛋白MbovP581是一种黏附蛋白，可望作为分子靶标开发和利用。更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。附图说明图1：pET-30a质粒图谱。图2：本专利技术构建的重组质粒pET-30a-Mbov_0581图谱。图3：是本专利技术纯化的牛支原体重组MbovP581(或写作rMbovP581)蛋白电泳图谱。附图标记说明：rP表示纯化后的rMbovP581蛋白。蛋白分子量为80kDa。图4：是本专利技术牛支原体MbovP581蛋白分泌性验证的westernblot图谱。附图标记说明：M：蛋白Marker；WP：牛支原体HB0801株全菌蛋白；Sec：牛支原体HB0801株分泌蛋白组。图5：是本专利技术牛支原体rMbovP581与人工感染牛支原体的牛血清反应的westernblot图谱。附图标记说明：M：蛋白Marker；1：rMbovP581蛋白与牛支原体感染后的牛血清反应组；2：rMbovP581蛋白与牛支原体阴性牛血清反应组。图6：是本专利技术牛支原体rMbovP581黏附EBL细胞图谱。附图标记说明：图6中的A图：黏附组中被DAPI染色的细胞核；图6中的B图：黏附组中被罗丹明染色为红色的F-actin；图6中的C图：黏附到EBL细胞上的FITC标记的rMbovP581蛋白；图6中的D图：rMbovP581黏附组融合图；图6中的E图：对照组融合图。图6中的F图：流式细胞术检测rMbovP581蛋白黏附到EBL细胞(p<0.001)。具体实施方式对序列表的说明：序列表SEQIDNO:1是本专利技术牛支原体Mbov_0581基因的核苷酸序列，序列长度为2103bp。序列表SEQIDNO:2是本专利技术牛支原体MbovP581蛋白的氨基酸序列，编码700个氨基酸。序列表SEQIDNO:3是本专利技术克隆的牛支原体Mbov_0581基因依据大肠杆菌密码子偏爱性通过人工突变的核苷酸序列，序列长度为2103bp。实施例1：牛支原体Mbov_0581基因克隆和表达纯化1.牛支原体Mbov_0581基因克隆和表达和MbovP0581纯化以牛支原体HB0801(基因组GenBank登录号为CP002058)中的Mbov_0581基因的核苷酸序列见SEQIDNO:1，序列大小为2103bp。以该原始序列为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG，突变后的序列见SEQIDNO:3，序列大小为2103bp。将SEQIDNO:3所示的序列送商业基因克隆公司进行合成。原基因序列和突变后的基因序列编码的蛋白质序列相同(序列见SEQIDNO:2)，编码700个氨基酸。将合成的Mbov_0581基因的扩增产物，用XhoI和BamHⅠ酶切，同时将pET-30a质粒(图谱见图1)(购自默克中国有限公司)用XhoI和BamHⅠ进行双酶切。将酶切后的Mbov_0581基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4DNAligase(购自NEB公司))进行连接，得到重组质粒pET-30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对牛肺上皮细胞具有黏附功能的牛支原体分泌蛋白基因MbovP581，其特征在于，该蛋白基因的蛋白质序列如SEQ ID NO:3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种对牛肺上皮细胞具有黏附功能的牛支原体分泌蛋白基因MbovP581，其特征在于，该蛋白基因的蛋白质序列如SEQIDNO:3所示。


2.如权利要求1所述的牛支原体分泌蛋白基因MbovP581，其特征在于，将SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱珍，穆罕默德·祖贝尔，赵刚，张慧，陈颖钰，胡长敏，陈曦，陈建国，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42