一种牛支原体假想蛋白MbovP732及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛支原体假想蛋白MbovP732，该蛋白具有如序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码所述蛋白的基因，具有如序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。该蛋白具有反应原性和免疫原性，能特异性地与牛支原体野毒株反应，而不能与疫苗株反应，因此可用于鉴别牛支原体野毒株感染与疫苗株免疫。

Mbovp732, a hypothetical protein of Mycoplasma bovis and its application

The invention discloses a Mycoplasma bovis hypothetical protein mbovp732, which has an amino acid sequence as shown in sequence list SEQ ID No: 1, a gene encoding the protein, and a nucleotide sequence as shown in sequence list SEQ ID No: 2. The protein is reactive and immunogenic. It can react with Mycoplasma bovis field strain specifically, but not with vaccine strain. Therefore, it can be used to identify Mycoplasma bovis field strain infection and vaccine strain immunity.

【技术实现步骤摘要】
一种牛支原体假想蛋白MbovP732及其应用
本专利技术属于动物传染病防治
，具体涉及到一种牛支原体假想蛋白MbovP732及其应用。
技术介绍
牛支原体(Mycoplasmabovis,M.bovis)是支原体属中牛的重要致病性病原，它能够引起牛的乳腺炎、肺炎、关节炎及角膜结膜炎等多种疾病，同时也是引起牛呼吸疾病综合征的主要病原。1961年，首次从美国患有严重乳腺炎的病牛中分离得到，之后便通过动物的迁徙在各个国家传播，对养牛业造成巨大的经济损失。在我国，2008年在湖北省从外地引进的肉牛群中爆发了呼吸系统疾病，牛群引进后大约两周发病，表现为发热、咳嗽、流鼻涕，犊牛和体质弱的肉牛发病严重。华中农业大学微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定，率先确定了该病为“传染性牛支原体肺炎”，之后陆续在新疆、宁夏、青岛等多个省份相继暴发相似的病例。传染性牛支原体肺炎发病率达到50-100％，病死率高达10-50％，严重威胁养牛业的发展。由于抗生素治疗牛支原体病效果不佳，商业化灭活疫苗不能有效减缓该病的发生，本实验室前期已经成功研制出牛支原体弱毒疫苗(HB150株)，通过临床动物试验证明该疫苗保护性好、安全性高、免疫保护期长。但由于动物感染牛支原体野毒与免疫弱毒疫苗均能够引起血清抗体的升高，而目前缺乏有效的血清学方法以区分牛支原体自然感染与疫苗免疫的群体，临床上难以判断弱毒疫苗是否免疫成功。本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室病毒分室通过比较基因组学与免疫蛋白质学发现牛支原体强弱菌株差异蛋白MbovP730蛋白具有很强的免疫原性和反应原性，并成功地将MbovP730蛋白作为鉴别诊断牛支原体野毒感染及疫苗免疫的分子靶标，该蛋白于2016年3月11日申请了专利技术专利，并在CN107176977A的专利文献中公开，但是MbovP730蛋白仍存在检测准确度不够高等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述缺陷，提供一个可以鉴别诊断牛支原体野毒感染与疫苗免疫动物的分子标识MbovP732蛋白。本专利技术的另一个目的在于提供一种检测牛支原体MbovP732蛋白抗体的特异性检测方法，用于区分牛支原体感染与否以及评价疫苗免疫效果，本专利技术的目的还包括重组MbovP732蛋白(即：His-rMbovP732)在鉴别诊断牛支原体野毒感染与疫苗免疫血清学方法中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施和路线：申请人所用的牛支原体HB0801株(武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2010040)为申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到，该牛支原体分离株已在CN109750054A的专利文献中公开。牛支原体HB150株(武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2011102)为申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室将牛支原体HB0801株体外连续传至150代所得到的弱毒株。本专利技术以牛支原体HB0801(基因组在GenBank上的登录号为CP002058)中Mbov_0732基因为基础，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，将编码色氨酸的密码子TGA优化为密码子TGG，同时将某些密码子进行优化使其在大肠杆菌中高效表达，人工合成优化后Mbov_0732基因。经过人工优化合成后的牛支原体基因Mbov_0732的核苷酸序列是序列表SEQIDNO:2的1-990位碱基所示的序列，其长度为990bp。该牛支原体MbovP732蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，共编码329个氨基酸。将本专利技术的牛支原体Mbov_0732基因的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-30a-Mbov_0732转化大肠杆菌DH5α得到重组的大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0732(EscherichiacolipET-30a-Mbov_0732)，于2019年5月20日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2019375。该菌株在IPTG诱导下，表达Mbov_0732基因编码的重组蛋白His-rMbovP732。经过验证，本专利技术纯化的His-rMbovP732蛋白具有反应原性和免疫原性，可以作为牛支原体血清抗体的诊断抗原，也可通过制备多克隆抗体进行牛支原体抗原检测。另外，His-rMbovP732蛋白能特异性地与牛支原体野毒株反应，而不能与疫苗株反应，因此可用于鉴别牛支原体野毒株感染与疫苗株免疫。尤其是，His-rMbovP732蛋白与本申请人之前公开的MbovP730蛋白相比，具有更好的反应原性和特异性，能更加准确地区分牛支原体野毒感染与弱毒疫苗免疫血清，因此更适合作为牛支原体鉴别诊断的靶抗原。本专利技术具有以下优点：1、本专利技术的抗原蛋白MbovP732是专利技术人从牛支原体HB0801株全菌蛋白中筛选出来的新型免疫原性蛋白。2、本专利技术的抗原蛋白MbovP732鉴别诊断牛支原体野毒株与弱毒疫苗株感染优于同类蛋白MbovP730，利用该蛋白抗原建立间接ELISA能有效区分牛支原体野毒感染与弱毒疫苗免疫群体。3、目前国内外市场上商品化牛支原体ELISA抗体检测试剂盒不能区分牛支原体野毒感染与疫苗免疫动物，本专利技术的抗原蛋白His-rMbovP732能够有效鉴别诊断野毒株与弱毒疫苗株，以本专利技术的蛋白制备的试剂盒能够为牛支原体弱毒疫苗HB150的应用提供配套诊断技术。更详细的专利技术方案见《具体实施方式》所述。附图说明图1：pET-30a的质粒图谱。pET-30a为商业化质粒，购自Novagen公司。图2：重组质粒pET-30a-Mbov_0732图谱。重组质粒pET-30a-Mbov_0732是由pET-30a质粒和优化合成后的Mbov_0732基因全长经过限制性内切酶消化后连接重组而成。图3：本专利技术纯化的牛支原体His-rMbovP732蛋白胶图。泳道M：蛋白质marker；1：纯化的牛支原体His-rMbovP732重组蛋白。图4：Westernblot分析His-rMbovP732蛋白的反应原性。泳道M：蛋白质marker；1：牛支原体HB0801攻毒阳性血清；2：牛支原体HB150免疫阳性血清；3：牛支原体阴性血清。图5：Westernblot分析His-rMbovP732蛋白在强弱菌株间差异表达。泳道M：蛋白质marker；1：牛支原体HB0801株全菌蛋白；2：牛支原体HB150株全菌蛋白。图6：His-rMbovP732蛋白作为包被抗原检测临床野毒感染、弱毒疫苗血清及阴性血清的结果。**P<0.01，***P<0.001。图7：His-rMbovP730蛋白作为包被抗原检测临床野毒感染、弱毒疫苗血清及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛支原体假想蛋白MbovP732，具有如序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种牛支原体假想蛋白MbovP732，具有如序列表SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。


2.编码权利要求1所述牛支原体假想蛋白MbovP732的基因，具有如序列表SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。


3.含有权利要求1所述牛支原体假想蛋白MbovP732的重组菌。


4.如权利要求3所述的重组菌，为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0732(EscherichiacolipET-30a-M...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱珍，聂晶晶，陈颖钰，杨莉，赵刚，胡长敏，陈曦，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42