多蛋白组合生物标志物及应用与心脏瓣膜病并发心房颤动诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种多蛋白组合生物标志物及应用与心脏瓣膜病并发心房颤动诊断试剂盒，所述多蛋白组合生物标志物由载脂蛋白A1蛋白抗体、血管紧张素原抗体、LIM结构域蛋白7、巨噬细胞集落刺激因子受体1、玻连蛋白抗体和凝血酶原片段F1+2抗体组成，本发明专利技术利用现代生物学技术和生物信息学分析发现联合应用这六种蛋白质具有预测心脏瓣膜病并发心房颤动的用途，可应用于制备靶向药物来早期干预相关疾病，还可应用于制备心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒，所述试剂盒通过对六种蛋白浓度测定后建模，对心脏瓣膜病患者是否发生心房颤动有着较好的评价效能和潜在的巨大应用价值。

【技术实现步骤摘要】
多蛋白组合生物标志物及应用与心脏瓣膜病并发心房颤动诊断试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其是涉及多蛋白组合生物标志物及应用与心脏瓣膜病并发心房颤动诊断试剂盒。
技术介绍
心房颤动(房颤，AF)是最常见的心律失常之一。房颤发生后，患者心房的有效收缩丧失，血液动力学改变，房室不同步，出现进行性心房心室功能障碍和血栓栓塞并发症，患者的死亡率增加。同时，房颤与中风，心肌梗死，心力衰竭，痴呆，慢性肾病等疾病的发生相关，且合并房颤能够增加疾病的死亡率。随着人口老龄化的加快，房颤患者将大量增加，给家庭和社会带来巨大的负担。目前针对房颤的治疗包括抗心律失常药物治疗，电复律，射频消融等介入治疗和外科手术治疗。房颤转为窦性心律后易反复发作，甚至发展为慢性及永久性房颤，治疗效果并不明显。而房颤发生的机制尚不完全清楚，多种疾病，包括心源性疾病和非心源性疾病，可造成心房组织的结果和/或电生理异常，从而改变心脏的自律性，和出发活动，促进异常活动的形成和传播，进而导致房颤发生。蛋白质是生命活动的主要承担者，不仅参与构建细胞的结构成分，还参与了几乎所有的细胞功能，传统的蛋白质研究需要将待研究的蛋白质分离提纯，再分析其化学结构和生物学活性，耗时耗力。蛋白质组学作为后基因组学的组成部分，可以从整体水平对多种蛋白进行鉴定并分析，这有助于寻找与房颤发生的有关分子机制，为发现安全有效的临床治疗奠定基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种多蛋白组合生物标志物。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述多蛋白组合生物标志物的应用。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供一种心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒。本专利技术采用的技术方案是：一种多蛋白组合生物标志物，由载脂蛋白A1蛋白抗体、血管紧张素原抗体、LIM结构域蛋白7、巨噬细胞集落刺激因子受体1、玻连蛋白抗体和凝血酶原片段F1+2抗体组成。上述多蛋白组合生物标志物在制备心脏瓣膜病并发心房颤动检测制剂或医疗器械方面的应用。优选的，上述多蛋白组合生物标志物的应用，所述医疗器械为心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒。一种应用上述多蛋白组合生物标志物的心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒，包含6种蛋白检测组：第一检测组包括：包被有载脂蛋白A1蛋白抗体的多孔板、载脂蛋白A1纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、样本稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，所述载脂蛋白A1标准品浓度为0,1.4,4,12,37,111,333,1000ng/ml；所述生物素标记抗体为生物素化的抗载脂蛋白A1抗体；所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.20.05％硫柳汞；所述样本稀释液为86％氯化钠、4.5％磷酸氢二钠、3.5％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；所述洗涤液：NaCl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；所述终止液：2mol/L硫酸；上述内容通过常规方法即可制备得到。上述内容的具体操作方法为：1)取离体血浆样本，检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:8000倍稀释后进行检测；2)标准品制备；3)操作步骤：a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；b)弃去孔内液体，甩干；c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.5小时；d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1小时；f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；h)每孔加终止液50μl，终止反应；i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；4)数据处理：使用CurveExpert(version1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入函数后得到各孔样本浓度值。第二检测组包括：包被有玻连蛋白抗体的多孔板、玻连蛋白纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、样本稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，所述玻连蛋白标准品浓度为0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100ng/ml；所述生物素标记抗体为生物素化的抗玻连蛋白抗体；所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.20.05％硫柳汞；所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；所述洗涤液：NaCl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；所述终止液：2mol/L硫酸；上述内容的具体操作方法为：1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:5000倍稀释后进行检测。2)标准品制备。3)操作步骤：a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加相应浓度标准品或待测样本50μl；b)立即加入辣根过氧化物酶标记亲和素50μl，再按同样顺序加入生物素标记抗体50μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育50分钟；c)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；d)每孔加底物溶液100μl，37摄氏度避光显色15分钟；e)每孔加终止液50μl，终止反应；f)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)。4)数据处理：使用CurveExpert(version1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入函数后得到各孔样本浓度值。第三检测组包括：包被有血管紧张素原抗体的多孔板、血管紧张素原蛋白纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、洗涤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多蛋白组合生物标志物，其特征在于：由载脂蛋白A1蛋白抗体、血管紧张素原抗体、LIM结构域蛋白7、巨噬细胞集落刺激因子受体1、玻连蛋白抗体和凝血酶原片段F1+2抗体组成。/n

【技术特征摘要】
20200826 CN 20201087027181.一种多蛋白组合生物标志物，其特征在于：由载脂蛋白A1蛋白抗体、血管紧张素原抗体、LIM结构域蛋白7、巨噬细胞集落刺激因子受体1、玻连蛋白抗体和凝血酶原片段F1+2抗体组成。


2.权利要求1所述多蛋白组合生物标志物在制备心脏瓣膜病并发心房颤动检测制剂或医疗器械方面的应用。


3.根据权利要求2所述的多蛋白组合生物标志物的应用，其特征在于：所述医疗器械为心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒。


4.一种应用权利要求1所述多蛋白组合生物标志物的心脏瓣膜病并发心房颤动筛查试剂盒，其特征在于：包含6种蛋白检测组：

第一检测组包括：包被有载脂蛋白A1蛋白抗体的多孔板、载脂蛋白A1纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、样本稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，
所述载脂蛋白A1标准品浓度为0,1.4,4,12,37,111,333,1000ng/ml；
所述生物素标记抗体为生物素化的抗载脂蛋白A1抗体；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；
所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.20.05％硫柳汞；
所述样本稀释液为86％氯化钠、4.5％磷酸氢二钠、3.5％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；
所述洗涤液：NaCl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；
所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；
所述终止液：2mol/L硫酸；

第二检测组包括：包被有玻连蛋白抗体的多孔板、玻连蛋白纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、样本稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，
所述玻连蛋白标准品浓度为0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100ng/ml；
所述生物素标记抗体为生物素化的抗玻连蛋白抗体；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；
所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.20.05％硫柳汞；
所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；
所述洗涤液：NaCl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；
所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；
所述终止液：2mol/L硫酸；

第三检测组包括：包被有血管紧张素原抗体的多孔板、血管紧张素原蛋白纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，
所述血管紧张素原蛋白标准品浓度0,78,156,312,625,1250,2500,5000pg/ml；
所述生物素标记抗体为生物素化的抗血管紧张素原抗体；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；
所述洗涤液：NaCl9.0g，0.5％吐温206ml，加蒸馏水至1000ml；
所述底物溶液为3,3’,5,5...

【专利技术属性】
技术研发人员：何国伟，李明阳，刘晓程，陈焕新，侯海涛，王君，杨沁，
申请(专利权)人：泰达国际心血管病医院，
类型：发明
国别省市：天津;12