一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，属于基因工程疫苗技术领域。本发明专利技术公开的一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，首先以GCRV‑I、II S10基因为靶基因，构建融合表达GCRV‑I、II衣壳蛋白的真核表达载体，并进行体外表达鉴定；第二阶段制备大肠杆菌DH5α菌蜕，将裂解质粒pHH43导入大肠杆菌DH5α，制备出具有完好外膜的大肠杆菌菌蜕；第三阶段进行大肠杆菌菌蜕装载重组质粒研制二价核酸菌蜕疫苗，并进行实验室免疫效果评价研究，初步确定了免疫方案并进行了免疫示范应用。

【技术实现步骤摘要】
一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法
本专利技术涉及基因工程疫苗
，更具体的说是涉及一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法。
技术介绍
草鱼出血病一直是我国草鱼养殖中最难控制的疾病，目前对于病毒病还没有特效的治疗方法，一直采用疫苗免疫作为控制该病的主要方法，最早全国各地相继应用组织浆灭活疫苗进行免疫防治，取得了一定的成效，但组织浆灭活疫苗需大量鱼体扩增病毒，费时费力，并存在扩散病毒的危险。后又研制成功细胞灭活疫苗及细胞培养弱毒疫苗并取得了疫苗生产批准文号，在多个地区进行了推广应用，对草鱼出血病的控制起了很大的作用，但细胞灭活疫苗的制备需大量培养病毒并传代扩增，成本很高，也存在灭活不完全会散毒的危险。弱毒活疫苗常能有效的刺激机体的免疫系统产生体液免疫和细胞免疫，其主要缺点是接种机体后毒力可能出现返强，以及运输保存时要求的条件较高。鉴于这些常规疫苗难以解决的问题以及GCRV出现新的毒力较强的变异毒株即GCRV-II在全国范围内流行的情况，迫切需要研制一种安全、高效且多价的疫苗用于预防草鱼出血病的爆发。核酸疫苗(nucleicacidvaccine)以其无致病性、研制简单等诸多优点成为现代疫苗的研究热点，该疫苗也称基因疫苗(geneticvaccine)或DNA疫苗(DNAvaccine)，是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基因克隆到真核表达质粒载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。该疫苗具有安全、价廉、易于制备、改造等优点，故一经问世便迅速发展起来，本实验室也研制了GCRV-IVP7的核酸疫苗，取得了一定的草鱼免疫效果。但越来越多的研究也发现核酸疫苗存在着免疫方式有限、免疫原性不强，常需高剂量多次免疫等问题。因而，人们开始转向对核酸疫苗佐剂和载体的研究，希望能够通过各种佐剂、载体的使用来扬长补短，使其免疫效果得到进一步提高。菌蜕的问世，为核酸的输送带来了新的希望，菌蜕是利用基因灭活的方法而产生的细菌空壳，即噬菌体PhiX174裂解蛋白E介导的G-菌的裂解而产生，由于G-菌具有完整的生物亲和性的外膜结构，如菌毛能够进行特异的细胞和组织定位，其表面的脂多糖成分可以作为一种天然佐剂，而且菌蜕的胞周间隙和细胞空腔可接收大量外源物质，因而菌蜕成为一种新型无病原性的生物载体和靶向工具，并且有望在增强核酸疫苗免疫原性、弥补其接种方式受限方面开辟一个新的途径，为更高效的DNA疫苗的开发提供一个具有广阔前景的技术平台。因此，提供一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，具体步骤如下：(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒；(2)制备大肠杆菌DH5α菌蜕；(3)制备GCRV二价核酸菌蜕疫苗：将步骤(2)制备的大肠杆菌DH5α菌蜕重悬于含GCRV-I-II-S10重组质粒的PBS体系中，加入CaCl2溶液，摇床孵育，离心，收集沉淀，得到GCRV二价核酸菌蜕疫苗。进一步，步骤(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒的具体步骤如下：①分别根据GCRV-I及GCRV-II第10基因片段序列，直接合成可融合表达的基因序列，并引入HindIII/EcoRI双酶切位点，基因序列如SEQIDNO.1所示；②利用HindIII和EcoRI对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，再将酶切产物用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化；③将步骤①获得的基因序列和步骤②酶切纯化后的pcDNA3.1(+)载体利用T4DNA连接酶16℃过夜连接；④将步骤③获得的连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有50μg·mL-1Amp+的LB平板上进行筛选，挑取白色菌落进行扩增，并小量提取质粒，进行双酶切鉴定，获得pcDNA-I-II-S10重组质粒。进一步，步骤(2)制备大肠杆菌DH5α菌蜕的具体步骤如下：①将裂解质粒pHH43转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有30mg/L氯霉素的固体LB平板进行筛选，挑取单个菌落小提质粒进行EcoRV和KpnI双酶切鉴定；②经鉴定，将含有裂解质粒pHH43的大肠杆菌于28℃200rpm摇床培养，当OD600＝0.4-0.6时，迅速升高温度至42℃以启动E裂解蛋白的表达，前期每隔20min、后期1h测定OD值，280min后挑选OD值最小的克隆菌进行菌蜕收集。进一步，步骤(3)制备GCRV二价核酸菌蜕疫苗的具体步骤如下：将0.5mL浓度为4.6×108CFU/mL菌蜕重悬于含762μgGCRV-I-II-S10重组质粒的4.5mL的PBS体系中，加入终浓度25mMCaCl2溶液，25℃、150rpm摇床孵育15min，8000rpm离心10min收集沉淀，再用PBS将沉淀悬浮稀释至使用浓度，得到GCRV二价核酸菌蜕疫苗。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，并进行了草鱼实验室免疫效果评价研究，高剂量(6μg/尾)腹腔及肌肉免疫组保护率分别为75％及71.4％，低剂量(0.6μg/尾)腹腔及肌肉免疫组保护率分别为71.4％和67.8％。根据实验室免疫效果评价及实际情况初步制订了草鱼二价核酸菌蜕疫苗免疫方案，即每年3月初放苗时进行免疫，二价核酸菌蜕疫苗菌蜕浓度为3.2×108CFU/mL，重组质粒装载量为0.6μg/100μL，体重为20g-50g的草鱼鱼种，每尾鱼腹腔注射100μL，51g-100g的草鱼鱼种，每尾鱼腹腔注射200μL。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术重组质粒pcDNA-I-II-S10酶切鉴定结果；其中，M：Marker；1：重组质粒双酶切产物；图2附图为本专利技术荧光显微镜观察融合基因在CHO和CIK中的表达(×200)；其中，A：CHO细胞；B：CIK细胞；图3附图为本专利技术阳性克隆双酶切鉴定；其中，M：2000bpMarker；1、3、4、5、6、7、8：单克隆EcoRV/KpnI双酶切；图4附图为本专利技术3号单克隆菌热诱导前后平板计数；其中，A：热诱导后，10-3稀释平板，32个单克隆；B：热诱导前，10-6稀释平板，122个单克隆；图5附图为本专利技术1、3、4号克隆菌以及对照组细菌DH5α生长与动态裂解曲线；其中，1号克隆菌：1DH5α(pHH43)；3号克隆菌：3DH5α(pHH43)；4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒；/n(2)制备大肠杆菌DH5α菌蜕；/n(3)制备GCRV二价核酸菌蜕疫苗：/n将步骤(2)制备的大肠杆菌DH5α菌蜕重悬于含GCRV-I-II-S10重组质粒的PBS体系中，加入CaCl

【技术特征摘要】
1.一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒；
(2)制备大肠杆菌DH5α菌蜕；
(3)制备GCRV二价核酸菌蜕疫苗：
将步骤(2)制备的大肠杆菌DH5α菌蜕重悬于含GCRV-I-II-S10重组质粒的PBS体系中，加入CaCl2溶液，摇床孵育，离心，收集沉淀，得到GCRV二价核酸菌蜕疫苗。


2.根据权利要求1所述的一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒的具体步骤如下：
①分别根据GCRV-I及GCRV-II第10基因片段序列，直接合成可融合表达的基因序列，并引入HindIII/EcoRI双酶切位点，基因序列如SEQIDNO.1所示；
②利用HindIII和EcoRI对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，再将酶切产物用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化；
③将步骤①获得的基因序列和步骤②酶切纯化后的pcDNA3.1(+)载体利用T4DNA连接酶16℃过夜连接；
④将步骤③获得的连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有50μg·mL-1Amp+的LB平板上进行筛选，挑取白色菌落进行扩增，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝贵杰，林锋，沈锦玉，盛鹏程，潘晓艺，袁雪梅，姚嘉赟，徐洋，陈智慧，黄小红，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33