一种抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法技术

本发明专利技术涉及一种抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法，包括以下步骤：1）、制斑马鱼模型组、斑马鱼治疗组和斑马鱼正常组；以上三组每隔1天更换相应培养水溶液；2）、观察步骤（1）制得的斑马鱼正常组、模型组和治疗组的形态和长度；3）、用茜素红染色法观察斑马鱼正常组、模型组和治疗组的颅骨骨骼，4）、用酶联免疫法检测斑马鱼正常组、模型组和治疗组的血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。本发明专利技术建立的斑马鱼糖尿病骨质疏松模型具有制作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点，用于药物功效评价时药物用量小，降低了糖尿病骨质疏松模型的制作成本和相关药物功效评价成本，提高了实验结果的可靠性和评价效率。

【技术实现步骤摘要】
一种抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法
本专利技术属于药物评价与筛选的
，具体涉及一种建立糖尿病骨质疏松斑马鱼模型的方法，以及运用该模型在评价药物抗糖尿病骨质疏松功效中的应用。
技术介绍
糖尿病骨质疏松症是指糖尿病并发骨量减少、骨微结构改变、骨强度降低、骨脆性增加等易发生骨折的一种退行性、全身性、代谢性骨骼疾病。糖尿病骨质疏松症临床治疗一般采用降糖药物、骨吸收抑制剂及骨形成促进剂等。但是存在降糖药物的骨形成促进效果不佳，双磷酸盐类、雌激素等易造成下颔部坏死、乳腺癌高发等副作用，甲状旁腺激素/类似肽、氟化物等有导致骨肉瘤或其他骨肿瘤的风险。糖尿病骨质疏松症的临床治疗效果不理想，亟需研究更加安全、经济有效的DOP治疗药物。目前，用于骨质疏松药物评价的动物模型主要由大鼠、小鼠和斑马鱼。相对于大鼠小鼠而言，斑马鱼个体小、药物用量小、生长周期快、繁殖和饲养成本第，是更具优势的骨质疏松模型动物。根据已有研究，糖尿病骨质疏松药物评价多用体外模型或基于大/小鼠的模型动物。体外模型的评价结果假阳性较高，而大/小鼠模型成本高、周期长，难以快速评价抗骨质疏松药物功效。因此缺乏快速有效的体内功效评价方法已成为该类药物研发的瓶颈问题。常用构建斑马鱼骨质疏松模型的药物为糖皮质激素类药物，如泼尼松龙和地塞米松。但是，以上方法无法造成高血糖、高血脂等糖尿病典型病理特征，难以模拟糖尿病病理环境中的骨丢失情况，不能真实评价抗糖尿病骨质疏松药物的功效。因此，本领域亟待提出一种评价抗糖尿病骨质疏松药物功效的方法，能够快速、高效地用于广泛评价和筛选抗糖尿病药物。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的目的是提供一种操作方便、成本低、化合物用量少、劳动强度低、且仅需在一般实验室就可以进行的抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下的技术方案：一种抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法，包括以下步骤：1）、将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于含有四氧嘧啶10-1000μM的培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼模型组；将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于含有四氧嘧啶10-1000μM、待测化合物浓度为0.1-1000μM的培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼治疗组；将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼正常组；以上三组每隔1天更换相应培养水溶液；2）、观察步骤（1）制得的斑马鱼正常组、模型组和治疗组的形态和长度；3）、用茜素红染色法观察斑马鱼正常组、模型组和治疗组的颅骨骨骼，包括以下步骤：3.1）、去除培养液，加入固定液将斑马鱼进行固定；3.2）、去除固定液，加入脱色液脱去斑马鱼色素；3.3）、脱水剂对斑马鱼进行脱水处理；3.4）、然后用染色液对斑马鱼进行染色；3.5）、用超纯水洗去染液，用透化剂透化斑马鱼；3.6）、取出斑马鱼，保存甘油中，用显微镜观察斑马鱼颅骨，记录并计算斑马鱼颅骨光密度；4）、用酶联免疫法检测斑马鱼正常组、模型组和治疗组的血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。作为优选方案，所述酶联免疫法分析步骤包括：第一步：将3-20尾斑马鱼合并为一个样本，去除培养液，用2-20mL生理盐水清洗3次，加入150-1000μL生理盐水；第二步：按照酶联免疫法试剂盒要求检测血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。作为优选方案，每尾鱼加入50μL生理盐水体积，用手持匀浆机或自动匀浆机进行匀浆，然后4℃离心5-20分钟，移取上清液作为酶联免疫法样品。作为优选方案，所述的固定液为质量浓度1-5%多聚甲醛水溶液，所述固定液处理时间为5-30分钟。作为优选方案，所述的脱色液组分包括质量浓度1-3%双氧水和0.5-2%KOH水溶液，所述脱色处理时间为5-120分钟。作为优选方案，所述脱水剂为10-90%乙醇水溶液；所述脱水处理时间为5-30分钟。作为优选方案，所述染色液为0.5%KOH配制的质量浓度1-10%茜素红溶液；所述染色处理时间为2-48小时。作为优选方案，所述透化剂包括三种溶剂：第一种，含0.375%KOH和25%甘油的水溶液；第二种含0.25%KOH和50%甘油的水溶液；第三种，含0.125%KOH和75%甘油的水溶液，所述透化处理步骤包括：第一步，采用以上第一种透化剂浸泡斑马鱼0.5-24小时，第二步，采用以上第二种透化剂浸泡斑马鱼0.5-24小时，第三步，采用以上第三种透化剂浸泡斑马鱼0.5-24小时。作为优选方案，所述显微镜观察为体式显微镜下观察，记录为拍照记录，计算为利用图像处理软件计算。本专利技术首次利用四氧嘧啶建立斑马鱼糖尿病骨质疏松模型，建立的斑马鱼糖尿病骨质疏松模型具有制作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点，用于药物功效评价时药物用量小，降低了糖尿病骨质疏松模型的制作成本和相关药物功效评价成本，提高了实验结果的可靠性和评价效率。本专利技术在利用四氧嘧啶建立斑马鱼糖尿病骨质疏松模型的前提下，采用首次将长度、颅骨面积、血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯多指标综合作为斑马鱼糖尿病骨质疏松的评价指标，更加科学、客观，提高了结果的准确性，客服了现有技术误差大的缺陷；本专利技术中所用的模式动物斑马鱼，既具有体外细胞株快速筛选、药物用量少的优点，有具有整体动物体内验证的优势，利用斑马鱼幼鱼进行大规模化合物的抗糖尿病骨质疏松功效评价，有助于提高实验效率和降低实验成本。附图说明图1为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼长度（L,μm）影响；图2为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼颅骨钙化面积（M）影响；图3为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼血糖(G,mmol/L)影响；图4为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼高密度脂蛋白(H,mmol/gprot)影响；图5为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼甘油三酯(T,mmol/gprot))影响；以上图中：A-空白组；B-100μM四氧嘧啶处理的模型组；C-300μM四氧嘧啶处理的模型组；D-500μM四氧嘧啶处理的模型组；E-700μM四氧嘧啶处理的模型组；F-25μM泼尼松龙处理的模型组；I-：300μM四氧嘧啶+100μM阿伦磷酸钠处理的治疗组；J：300μM四氧嘧啶+1μM二甲双胍处理的治疗组；K：300μM四氧嘧啶+25μM知母皂苷BII处理的治疗组。**：与空白组比较，P<0.01;*：与空白组比较，P<0.05。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例1：斑马鱼糖尿病骨质疏松模型的建立和验证（1）斑马鱼幼鱼的获得与使用采用斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心，按雌雄1/1的比例放入交配缸内，光照刺激使其排卵。收集受精卵，移入斑马鱼胚胎培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1）、将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于含有四氧嘧啶10-1000μM的培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼模型组；将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于含有四氧嘧啶10-1000μM、待测化合物浓度为0.1-1000μM的培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼治疗组；将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼正常组；以上三组每隔1天更换相应培养水溶液；/n2）、观察步骤（1）制得的斑马鱼正常组、模型组和治疗组的形态和长度；/n3）、用茜素红染色法观察斑马鱼正常组、模型组和治疗组的颅骨骨骼，包括以下步骤：/n3.1）、去除培养液，加入固定液将斑马鱼进行固定；/n3.2）、去除固定液，加入脱色液脱去斑马鱼色素；/n3.3）、脱水剂对斑马鱼进行脱水处理；/n3.4）、然后用染色液对斑马鱼进行染色；/n3.5）、用超纯水洗去染液，用透化剂透化斑马鱼；/n3.6）、取出斑马鱼，保存甘油中，用显微镜观察斑马鱼颅骨，记录并计算斑马鱼颅骨光密度；/n4）、用酶联免疫法检测斑马鱼正常组、模型组和治疗组的血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。/n...

【技术特征摘要】
1.一种抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于含有四氧嘧啶10-1000μM的培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼模型组；将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于含有四氧嘧啶10-1000μM、待测化合物浓度为0.1-1000μM的培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼治疗组；将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼正常组；以上三组每隔1天更换相应培养水溶液；
2）、观察步骤（1）制得的斑马鱼正常组、模型组和治疗组的形态和长度；
3）、用茜素红染色法观察斑马鱼正常组、模型组和治疗组的颅骨骨骼，包括以下步骤：
3.1）、去除培养液，加入固定液将斑马鱼进行固定；
3.2）、去除固定液，加入脱色液脱去斑马鱼色素；
3.3）、脱水剂对斑马鱼进行脱水处理；
3.4）、然后用染色液对斑马鱼进行染色；
3.5）、用超纯水洗去染液，用透化剂透化斑马鱼；
3.6）、取出斑马鱼，保存甘油中，用显微镜观察斑马鱼颅骨，记录并计算斑马鱼颅骨光密度；
4）、用酶联免疫法检测斑马鱼正常组、模型组和治疗组的血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。


2.根据权利要求1所述的一种抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法，其特征在于，所述酶联免疫法分析步骤包括：
第一步：将3-20尾斑马鱼合并为一个样本，去除培养液，用2-20mL生理盐水清洗3次，加入150-1000μL生理盐水；
第二步：按照酶联免疫法试剂盒要求检测血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。


3.根据权利要求2所述的一种抗糖尿病骨质疏松药物评价...

【专利技术属性】
技术研发人员：王娜妮，许平翠，王斌杰，姚伟宣，俞忠明，
申请(专利权)人：浙江省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33