一种PEA检测用的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提出了一种PEA检测用的试剂盒及其使用方法，包括PEA蛋白、抗PEA抗体、SABC、酶标板、酶底物溶液、稀释液、洗涤液和终止液，PEA蛋白作为生化指标，抗PEA抗体用生物素标记作为检测抗体标记物，抗PEA抗体包被的酶标板作为固相载体，SABC用于放大检测信号；本发明专利技术以生物素标记抗体作为检测抗体，采用双抗体夹心法提高ELISA检测的特异性和精确性，再利用SABC放大了检测信号，从而大大提高了检测的灵敏度，相比现有的实验室检测手段，高效迅速，操作流程短难度低，成本低廉。

【技术实现步骤摘要】
一种PEA检测用的试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及抗原检测
，尤其涉及一种PEA检测用的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
假单孢菌又称绿脓杆菌，是一种条件致病菌，几乎可以感染人所有的体表组织和器官，由于假单胞菌在人体和自然界广泛存在，并且对多种抗生素不敏感，加之多种传播途径，它引起的医院内感染已成为控制院内交叉感染的棘手问题。假单孢菌主要的毒力因子为外毒素A，即PEA，其为细菌感染过程中细菌体内产生的一种胞外酶。PEA合成后为71kd的前体蛋白。去掉25个氨基酸的信号序列后，以66kd的成熟蛋白形式分泌到上清。它有613个氨基酸残基组成，分3个结构功能区：I区为氨基酸末端区，与靶细胞识别有关，能与相应的表面受体结合；II区为跨膜区，与毒素的迁移定位有关；III区为羧基末端区，具有ADP-核糖基转移酶活性，为毒素分子的活性部分。PEA与靶细胞表面受体结合，通过膜运动聚集于膜特化区。胞膜内陷形成胞内泡，小泡与溶酶体融合。PEA在转移定位至靶细胞的胞质溶胶后，通过抑制蛋白质合成导致细胞病变。研究证实，PEA在非毒性剂量下会影响免疫系统，从而抑制抗原抗体反应，并且PEA在体外实验中还能抑制淋巴细胞的转化。经过长期实验发现，抗PEA抗体在假单孢菌感染的小鼠中表现出保护性作用。PEA作为假单胞菌的主要毒力因子，成为评价假单孢菌感染的一个重要指标。目前，针对于PEA的检测主要采用荧光定量检测，检测用的RT-PCR设备成本高，且检测流程时间长，操作难度大，普遍仅适用于实验室研究。因此，开发一种特异性强，灵敏度高，使用方便，快速检测PEA的试剂盒对于研究假单胞菌的作用机理具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种检测迅速，特异性强，灵敏度高，使用方便的PEA检测用的试剂盒及其使用方法。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种PEA检测用的试剂盒，包括PEA蛋白、抗PEA抗体、SABC、酶标板、酶底物溶液、稀释液、洗涤液和终止液，PEA蛋白作为生化指标，抗PEA抗体用生物素标记作为检测抗体标记物，抗PEA抗体包被的酶标板作为固相载体，SABC用于放大检测信号。在以上技术方案的基础上，优选的，PEA蛋白为大肠杆菌表达的重组蛋白，其氨基酸序列为GPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAIS。在以上技术方案的基础上，优选的，抗PEA抗体为抗PEA的多克隆抗体，其制备方法包括，用PEA蛋白免疫兔子获得含有抗PEA抗体的血清，再将血清经过PEA亲和柱纯化，并浓缩和透析后获得纯化的多克隆抗体。在以上技术方案的基础上，优选的，酶标板为96孔酶标板。在以上技术方案的基础上，优选的，酶底物溶液为TMB应用液。在以上技术方案的基础上，优选的，稀释液为10mmol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有1％的牛血清白蛋白和0.1％的proclin300。在以上技术方案的基础上，优选的，洗涤液为10mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有0.05％Tween-20和0.1％的proclin300。在以上技术方案的基础上，优选的，终止液为1.0mol/LH2SO4溶液。另一方面，提供了一种PEA检测用的试剂盒的使用方法，包括以下步骤，S1将待检样品用稀释液稀释后，投入酶标板的微孔中，使待检样品中的PEA与固相载体上的抗PEA抗体结合，用洗涤液洗去未结合的杂蛋白和其他物质；S2使步骤S1中的获得物与检测抗体标记物结合，用洗涤液洗去多余的生物素标记抗体；S3向步骤S2中的获得物加入SABC，使SABC和生物素标记抗体形成复合物，用洗涤液洗去多余的SABC；S4向步骤S3中的的获得物加入酶底物溶液，37℃下进行孵育反应，用终止液终止酶反应后检测显色强度。本专利技术的一种PEA检测用的试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：(1)本专利技术设计了一种新型的试剂盒，以生物素标记抗体作为检测抗体，采用双抗体夹心法提高检测的特异性和精确性，再利用SABC放大了检测信号，从而大大提高了ELISA检测的灵敏度，相比现有的实验室检测手段，高效迅速，操作流程短难度低，成本低廉。(2)本专利技术中采用的蛋白为大肠杆菌表达的重组蛋白，特异性强，且兔免疫获得的抗体为多克隆体抗体，相较于现有的检测手段普遍使用的单抗或单抗和多抗组合，在保证了检测的快速、精确和灵敏的基础上，其获取手段更方便简单，成本更低。附图说明图1为本专利技术的实施例1至3的PEA剂量(浓度)-反应(吸光度)曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本专利技术的一种PEA检测用的试剂盒，包括PEA蛋白、抗PEA抗体、SABC、酶标板、TMB应用液、含有1％的牛血清白蛋白和0.1％的proclin300的10mmol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液、含有0.05％Tween-20和0.1％的proclin300的0.25mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液和1.0mol/LH2SO4溶液，PEA蛋白作为生化指标，抗PEA抗体用生物素标记作为检测抗体标记物，抗PEA抗体包被96孔酶标板作为固相载体，SABC用于放大检测信号。其中，PEA蛋白为大肠杆菌表达的重组蛋白，其氨基酸序列为GPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAIS。具体的，抗PEA抗体为抗PEA的多克隆抗体，其制备方法包括，用PEA蛋白免疫兔子获得含有抗PEA抗体的血清，再将血清经过PEA亲和柱纯化，并浓缩和透析后获得纯化的多克隆抗体。另一方面，其使用方法，包括以下步骤，S1将待检样品用含有1％的牛血清白蛋白和0.1％的proclin300的10mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液稀释后，投入酶标板本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PEA检测用的试剂盒，包括PEA蛋白、抗PEA抗体、SABC、酶标板、酶底物溶液、稀释液、洗涤液和终止液，其特征在于：所述PEA蛋白作为生化指标，所述抗PEA抗体用生物素标记作为检测抗体标记物，所述抗PEA抗体包被的酶标板作为固相载体，所述SABC用于放大检测信号。/n

【技术特征摘要】
1.一种PEA检测用的试剂盒，包括PEA蛋白、抗PEA抗体、SABC、酶标板、酶底物溶液、稀释液、洗涤液和终止液，其特征在于：所述PEA蛋白作为生化指标，所述抗PEA抗体用生物素标记作为检测抗体标记物，所述抗PEA抗体包被的酶标板作为固相载体，所述SABC用于放大检测信号。


2.根据权利要求1所述的一种PEA检测用的试剂盒，其特征在于：所述PEA蛋白为大肠杆菌表达的重组蛋白，其氨基酸序列为GPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAIS。


3.根据权利要求1所述的一种PEA检测用的试剂盒，其特征在于：所述抗PEA抗体为抗PEA的多克隆抗体，其制备方法包括，用PEA蛋白免疫兔子获得含有抗PEA抗体的血清，再将所述血清经过PEA亲和柱纯化，并浓缩和透析后获得纯化的所述多克隆抗体。


4.根据权利要求1所述的一种PEA检测用的试剂盒，其特征在于：所述酶标板为96孔酶标板。

【专利技术属性】
技术研发人员：董垚，张丽嫒，
申请(专利权)人：武汉菲恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42