一种适用于细胞三维培养的水凝胶及其制备方法技术

一种适用于细胞三维培养的水凝胶及其制备方法，通过3D打印出构建水凝胶成型的模具，消毒后备用；按照一定的比例混合胶原‑NaOH溶液、钙离子交联溶液、海藻酸钠溶液、改良伊格尔培养基(DMEM培养基，Dulbecco’s Modified Eagle Medium)及细胞悬液，在快速的震荡混匀后，得到清澈透亮的胶体溶液，并转移至模具中，37℃恒温培养箱培养1h后成型；本发明专利技术具有良好的生物相容性、安全性和可降解性，操作步骤简单，成胶效果稳定的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于细胞三维培养的水凝胶及其制备方法
本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种适用于细胞三维培养的水凝胶及其制备方法。
技术介绍
水凝胶是一种水溶胀的聚合材料，可保持独特的三维结构，在组织工程学中已经得到了广泛的应用。传统合成方法已研发出具有优异性能的水凝胶，譬如隐形眼镜以及一些生物植入材料等，但是在合成反应过程中难以实现精确的控制，成型后的水凝胶机械性能较差是传统水凝胶的一大限制因素；除此之外，材料的选择对于水凝胶中细胞的生活状态与生物学功能也有着至关重要的影响，需要进行多方面的考量，譬如材料的可塑性、生物相容性、安全性以及渗透性等，而目前这方面的研究还有诸多不足。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种适用于细胞三维培养的水凝胶及其制备方法，本专利技术建立在胶原水凝胶的基础上，引入海藻酸盐，并进行Ga2+交联，按照一定的比例，程序化地混合胶原溶液、海藻酸盐溶液、Ga2+交联液及细胞悬液，并借助特定的模具，对成胶过程进行精准地把控，规避了可能出现的问题，得到性质稳定的三维培养水凝胶载体；具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于细胞三维培养的水凝胶，其特征在于：其原料包括胶原、海藻酸盐、钙离子交联液(CaCO3-GDL)、CaSO4、NAOH和DEME细胞培养基；以1ml水凝胶体系为例，各组份含量如下：/n胶原：配制浓度为10-12mg/ml，体积为0.46-0.56ml；/n海藻酸盐：配制浓度5-10mg/ml，体积为0.2ml；/n钙离子交联液(CaCO3-GDL)：配制浓度为0.5-0.8mmol/L，体积为0.05ml；/nCaSO4：配制浓度为1-1.5mmol/L，体积为0.025ml；/nNAOH：配制浓度为2.2-2.8mmol/L，体积为0.0107-0.0128ml；/nDEME细胞...

【技术特征摘要】
1.一种适用于细胞三维培养的水凝胶，其特征在于：其原料包括胶原、海藻酸盐、钙离子交联液(CaCO3-GDL)、CaSO4、NAOH和DEME细胞培养基；以1ml水凝胶体系为例，各组份含量如下：
胶原：配制浓度为10-12mg/ml，体积为0.46-0.56ml；
海藻酸盐：配制浓度5-10mg/ml，体积为0.2ml；
钙离子交联液(CaCO3-GDL)：配制浓度为0.5-0.8mmol/L，体积为0.05ml；
CaSO4：配制浓度为1-1.5mmol/L，体积为0.025ml；
NAOH：配制浓度为2.2-2.8mmol/L，体积为0.0107-0.0128ml；
DEME细胞培养基：体积为0.152ml-0.254ml。


2.根据权利要求1所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶，其特征在于：所述的海藻酸盐包括但不限于海藻酸钠、海藻酸钾。


3.根据权利要求1所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶，其特征在于：所述的胶原为从新鲜鼠尾、牛跟腱或猪皮中提取。


4.基于权利要求1至3任一权利要求所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，以制备1ml水凝胶为例：
1)配制NAOH溶液：取NAOH粉末0.88-1.12g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.2-2.8mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2)配制钙离子交联液(CaCO3-GDL)：取CaCO3-GDL粉末0.87-1.39g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.5-0.8mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3)配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末1.72-2.58g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1-1.5mmol/L的溶液，封口，4℃保存备用；
4)配制海藻酸盐溶液：取海藻酸盐粉末0.05-0.1g，放入干净的广口瓶，加入10ml无血清DMEM培养基，终浓度为5-10mg/ml；在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45μm的滤器过滤除菌；封口，4℃保存备用；
5)配制Ⅳ型胶原酶：称重80-100mgⅣ型胶原酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为0.8-1mg/ml；4℃保存备用；
6)配制海藻酸盐裂解酶：称重25-30mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为250-300μg/ml；4℃保存备用；
7)配制胶原溶液，配制浓度为10-12mg/ml，体积为0.46-0.56ml；
步骤三：成胶及细胞包埋
1)取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.46-0.56ml转移至1.5mlEP管中，加入DEME细胞培养基0.1-0.15ml混合，记为溶液1；
2)取4℃冷藏的海藻酸盐溶液0.2ml与DEME细胞培养基0.05-0.07ml相混合，记为溶液2；
3)将0.05ml的钙离子交联液(CaCO3-GDL)、0.025ml的DEME细胞培养基与0.025ml的CaSO4溶液相混合，记为溶液3；
4)将溶液1、溶液2混匀；
5)将使用胰酶消化并收集的细胞计数至1-10×105个/ml得细胞悬液，将所得细胞悬液加入步骤三第4)步所得到溶液1、溶液2的混合液中混匀；
6)在步骤三第5)步得到的混合液中加入溶液3进行钙离子的交联，观察到液体浑浊并有白色絮状沉淀产生；
7)在步骤三第6)步得到的混合液中加入NaOH溶液0.0107-0.0128ml，调节PH至中性，液体恢复均一清澈，无明显沉淀；
8)将成型模具放入中皿中，加入在步骤三第7)步得到的混合液后移入培养箱中，36-38℃条件下混合液固化成型，得到固化的水凝胶；
9)40min-1h后将固化的水凝胶移出，移除模具。


5.根据权利要求4所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤二第7)步配制胶原溶液的具体方法为：
a)取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻0.5-1h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b)所有器械置于冰盒预冷4℃，0.5-1h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮，使用血管钳，每间隔1.5-2.0cm折断鼠尾筋骨；
c)固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端约0.5-1.0cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至4-8℃冷水中；
d)对得到的鼠尾肌腱进行清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，以预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液按1-1.2g：100ml的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解4-5天直至完全溶解；
e)将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，10000-12000r/s离心1.5-2h后取上清液，倒入100-150mm培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f)将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，3-5天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g)取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为10-12mg/ml；
h)按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，8-12h后吸出胶原溶液，并避光敞口2-4h以挥发胶原中多余三氯甲烷，4℃保存待用。


6.根据权利要求4或5所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，以制备1ml水凝胶为例：
1)配制NAOH溶液：取NAOH粉末0.96g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.4mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2)配制钙离子交联液(CaCO3-GDL)：取CaCO3-GDL粉末0.87g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.5mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3)配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末1.72g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1mmol/L的溶液，封口，4℃保存备用；
4)配制海藻酸钠溶液：取海藻酸钠粉末0.05g，放入干净的广口瓶，加入10ml无血清DMEM培养基，终浓度为5mg/ml；在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45μm的滤器过滤除菌，封口，4℃保存备用；
5)配制Ⅳ型胶原酶：称重约80mgⅣ型胶原酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为0.8mg/ml；4℃保存备用；
6)配制海藻酸盐裂解酶：称重约25mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为250μg/ml，4℃保存备用；
7)配制胶原溶液：
a)取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻0.5h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b)所有器械置于冰盒预冷4℃，0.5h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮，使用血管钳，每间隔1.5cm折断鼠尾筋骨；
c)固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端约0.5cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至4℃冷水中；
d)对得到的鼠尾肌腱进行仔细的清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，以预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液按1g：100ml的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解4天直至完全溶解；
e)将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，11000r/s离心1.5h后取上清液，倒入培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f)将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，3天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g)取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为10mg/ml；
h)按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，10h后吸出胶原溶液，并避光敞口2h以挥发胶原中多余三氯甲烷；4℃保存待用；
步骤三：成胶及细胞包埋：
1)取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.56ml转移至1.5mlEP管中，加入DEME细胞培养基0.1ml混合，记为溶液1；
2)取4℃冷藏的0.2ml海藻酸钠溶液与0.027ml的DEME细胞培养基相混合，记为溶液2；
3)将0.05ml的钙离子交联液(...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹蕊，吴诗阳，牛林，郑丹青，亢雪萍，王译婕，赵舒扬，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61