一种组织工程软骨的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种组织工程软骨的制备方法，包括以下步骤：S1、胶原基质的制备：将Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原加入至无菌管中，向其中加入在4℃下预冷的高糖DMEM培养基，经充分混合后，静置备用；S2、间充质干细胞的制备：将人间充质干细胞按1×10

【技术实现步骤摘要】
一种组织工程软骨的制备方法及其应用
本专利技术涉及医用材料
，具体涉及一种组织工程软骨的制备方法。
技术介绍
因创伤、炎症、退变、肿瘤切除等原因导致的关节软骨损伤是临床上常见的疾病。由于软骨内缺乏血管组织，而且软骨组织细胞被包裹在基质成分中，不能迁移到损伤部位修复缺损，致使软骨损伤后的再生及修复能力很差，软骨损伤若不及时治疗，容易造成关节弹响、僵硬、疼痛加重等，最终需要进行关节置换，严重影响患者生活质量。传统的治疗方法有关节灌洗术、关节清理术、微骨折手术、骨膜移植、软骨移植和自体软骨细胞移植等，已广泛用于关节软骨的损伤修复，但临床应用结果显示，这些方法均存在不足。例如，关节清理术只能暂时缓解症状，不能有效治疗软骨损伤；微骨折手术只能在缺损部位再生纤维软骨，不能达到正常软骨的力学要求，存在后期退化的隐患；自体软骨移植效果较好，仅适用于软骨缺损面积较小的损伤治疗；异体软骨移植可用于较大缺损修复，但供体来源有限，并有感染传染病、免疫排斥的风险。临床研究还表明，软骨细胞移植是目前修复关节软骨损伤、实现功能重建的有效途径；其第一代移植技术需要采用患者自体骨膜封闭缺损位置，增加了对患者的损伤，易形成骨膜肥大，需要二次手术；第二代技术采用胶原/透明质酸膜代替自体骨膜封闭缺损表面，移植细胞悬液易造成软骨细胞渗漏，使新生软骨表面不平整；第三代技术是在胶原膜上直接种植细胞，以纤维蛋白胶作为固定液，贴附至软骨缺损部位，以期形成均匀的软骨，但临床结果显示，该技术生成的软骨大部分为纤维软骨，疗效不及第一代技术稳定，是由于软骨细胞不能穿透胶原膜，只能在胶原膜表面贴附生长，该材料在植入缺损位置后，形成的软骨组织多为纤维软骨，比正常软骨的力学性能差、易退化。基于软骨组织的结构，如何在体外条件下构建组织工程软骨，用于软骨损伤的修复，为软骨缺损治疗提供更好的选择，具有很好的临床应用价值。
技术实现思路
为了解决上述
技术介绍
中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种组织工程软骨的制备方法，该制备方法具有流程简单，制备的组织工程软骨能够根据实际需要进行形状设定，具有较强生物力学性能及生物相容性，适用范围广。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种组织工程软骨的制备方法，包括以下步骤：S1、胶原基质的制备：将无菌、具有生物活性且未变性的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原加入至无菌管中，向其中加入在4℃下预冷的高糖DMEM培养基，在4℃温度下经充分混合后，静置备用；S2、间充质干细胞的制备：选取状态良好的人间充质干细胞按1×107个细胞/cm2的浓度悬浮至诱导培养基中得到细胞悬液；S3、培养制备：向上述步骤S2中准备好的1mL细胞悬液内加入上述步骤S1中制备出的胶原基质，充分混合后，置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中过夜，随后缓慢加入5mL诱导培养基，避免将沉淀吹起，置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱继续培养，48小时后缓慢吸取上清液，然后缓慢加入新鲜的诱导培养基继续培养，每48小时更换一次新鲜的诱导培养液，15天后即得组织工程软骨。进一步地，所述步骤S2和所述步骤S3中，诱导培养基为含有谷氨酰胺、抗坏血酸200μM、丙酮酸钠1mM、地塞米松0.1μM、脯氨酸4mM、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的100mL高糖DMEM培养基。进一步地，所述步骤S2中，人间充质干细胞来源于骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、脐带、羊膜等。进一步地，所述步骤S1中，Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原用量为200mg，加入1mL在4℃下预冷的高糖DMEM培养基。进一步地，所述步骤S3中，每次加入新鲜的诱导培养基的用量为5mL。本专利技术所制备出的组织工程软骨的应用，完成培养得到的组织工程软骨经过塑形、清洗，介入到需要修补的组织处。其中，所述塑性过程中使用生理盐水保持组织工程软骨湿润，所述组织工程软骨可叠加使用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术使用具有生物活性的胶原作为工程支架材料，该材料具有优异的生物相容性，经过特殊处理，即可被组织吸收重建，又不会诱发免疫反应；(2)组织工程细胞选择间充质干细胞，该类型细胞来源广泛，且不具有免疫原性，同时又可使用自身细胞，进一步降低了免疫及其他生物风险；(3)经过该方法制备出的组织工程软骨模拟体内骨，可以根据实际需要进行形状设定，嵌入体内后可以完全和体内组织进行融合，进而生长成自身的一部分，达到组织再生的目的，完全避免了固定性的组织材料与机体生长和退化不能同步的问题；(4)此外，通过该方法制备出的组织工程软骨也可进行塑形、拼合和体内成熟，应用方便，是较理想的再生医学终产品和材料性产品。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细的说明。本专利技术涉及的组织工程软骨的制备方法，包括以下步骤：S1、胶原基质的制备：将无菌、具有生物活性且未变性的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原200mg加入至5mL的无菌管中，向其中加入1mL在4℃下预冷的高糖DMEM培养基，在4℃温度下经充分混合后，静置备用；S2、间充质干细胞的制备：选取状态良好的人间充质干细胞按1×107个细胞/cm2的浓度悬浮至诱导培养基中得到细胞悬液；S3、培养制备：向上述步骤S2中准备好的1mL细胞悬液内加入上述步骤S1中制备出的胶原基质，充分混合后，置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中过夜，随后缓慢加入5mL诱导培养基，避免将沉淀吹起，置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱继续培养，48小时后缓慢吸取上清液，然后缓慢加入5mL新鲜的诱导培养基继续培养，每48小时更换一次新鲜的诱导培养液，15天后即得组织工程软骨。S4、保存：制备出的组织工程软骨应立即使用，不宜存储过长时间，在4℃条件下可存放12小时。其中，所述步骤S2和所述步骤S3中，诱导培养基为含有谷氨酰胺、抗坏血酸200μM、丙酮酸钠1mM、地塞米松0.1μM、脯氨酸4mM、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的100mL高糖DMEM培养基。其中，所述步骤S2中，人间充质干细胞来源于骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、脐带、羊膜等。本专利技术所制备出的组织工程软骨的应用，完成培养得到的组织工程软骨经过塑形，塑形手法可选用手术刀修块法，或采用三维切割仪安装需要的形状塑形，塑形过程中使用生理盐水保持组织工程软骨湿润。塑形完成后，用生理盐水清洗，根据需要介入到需要修补的组织处。其中，组织工程软骨可叠加使用。使用阿利新蓝对制备出的组织工程软骨进行染色，可以明显看见蓝色着色，说明细胞已经具有了成软骨的能力，并具有了部分软骨的特性。本专利技术使用生物活性的胶原作为工程支架材料，该材料具有优异的生物相容性，经过特殊处理，即可被组织吸收重建，又不会诱发免疫反应；组织工程细胞选择间充质干细胞，该类型细胞来源广泛，且不具有免疫原性，同时又可使用自身细胞，进一步降低了免疫及其他生物风险；经过该方法制备出的组织工程软骨模拟体内骨，可以根据实际本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组织工程软骨的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、胶原基质的制备：将无菌、具有生物活性且未变性的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原加入至无菌管中，向其中加入在4℃下预冷的高糖DMEM培养基，在4℃温度下经充分混合后，静置备用；/nS2、间充质干细胞的制备：选取状态良好的人间充质干细胞按1×10

【技术特征摘要】
1.一种组织工程软骨的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、胶原基质的制备：将无菌、具有生物活性且未变性的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原加入至无菌管中，向其中加入在4℃下预冷的高糖DMEM培养基，在4℃温度下经充分混合后，静置备用；
S2、间充质干细胞的制备：选取状态良好的人间充质干细胞按1×107个细胞/cm2的浓度悬浮至诱导培养基中得到细胞悬液；
S3、培养制备：向上述步骤S2中准备好的1mL细胞悬液内加入上述步骤S1中制备出的胶原基质，充分混合后，置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中过夜，随后缓慢加入5mL诱导培养基，避免将沉淀吹起，置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱继续培养，48小时后缓慢吸取上清液，然后缓慢加入新鲜的诱导培养基继续培养，每48小时更换一次新鲜的诱导培养液，15天后即得组织工程软骨。


2.根据权利要求1所述的组织工程软骨的制备方法，其特征在于，所述步骤S2和所述步骤S3中，诱导培养基为含有谷氨酰胺、抗坏血酸200μM、...

【专利技术属性】
技术研发人员：董永聘，李文放，江伟伟，冯荣，
申请(专利权)人：弗元上海生物科技有限公司，上海长征医院，
类型：发明
国别省市：上海;31