酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒。该检测方法是样品经过氧化石墨烯脱色后，经过组胺‑N‑甲基转移酶、S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶、腺嘌呤核苷酶和核糖‑1‑脱氢酶的酶偶联反应，分光光度法在340nm处检测NADPH的生成量，从而准确定量样品中组胺的含量。基于该方法的试剂盒，检测操作简单、结果重现性好、加标回收率高、不需要大型仪器，可用于中小企业和基层实验室的检测。

【技术实现步骤摘要】
酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒
本专利技术涉及食品加工、生物化学、检测试剂领域，具体涉及的是一种酱油和醋中组胺的酶偶联分析检测技术，及其基于该技术开发的检测试剂盒。
技术介绍
组胺是生物胺的一种，是生物体内组氨酸在脱羧酶作用下的产物。组胺普遍存在于酱油、醋、黄酒等发酵食品中。食品中的组胺残留容易引物食品安全问题，如口服8～40mg组胺会产生轻微中毒症状，超过40mg会产生中等中毒症状，超过100mg会产生严重中毒症状。因此，组胺是一类潜在的食品危害因子。食品中组胺的检测方法主要有分光光度法、酶联免疫法、电化学生物传感器法、薄层色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等，其中高效液相色谱法是目前应用最多的检测食品中组胺的方法。目前报道的分光光度法检测组胺，存在操作步骤多、测定结果不稳定、平行性差等缺点，而高效液相色谱法等方法需要用到大型仪器，操作也较为复杂，检测时间较长，不适合于中小企业和基层单位使用。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述不足，提出了一种基于多酶偶联的方法，用于检测酱油和醋等食品中的组胺，该方法操作简单、测定结果平行性好、稳定可靠，定量反应准确。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种酱油和醋中组胺的测定方法，过程为：酱油和醋中的组胺经脱色后，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，经组胺-N-甲基转移酶作用生成t-甲基组胺和S-腺苷同型半胱氨酸，后者再经S-腺苷同型半胱氨酸水解酶迅速转化成同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷。腺嘌呤核苷再经腺嘌呤核苷酶作用，水解成腺嘌呤和核糖，而核糖迅速被核糖-1-脱氢酶氧化，生成核糖酸和NADPH。利用NADP+和NADPH在340nm吸光度差异，可以定量NADPH的生成量，从而确定组胺的含量。在一些具体实施方式中，本专利技术提供的组胺的测定方法具体包括如下步骤：取酱油或醋样品溶液到离心管中，加入氧化石墨烯，振荡混匀，离心收集上清液，为待测溶液；取待测溶液入试管中，加入蒸馏水，混匀；加入试剂1，混匀，再加入试剂2，混匀，于37℃水浴中保温反应10min，于分光光度计中340nm测定吸光度值；根据标准曲线和稀释倍数计算出样品中组胺含量；其中，所述的试剂1与试剂2的体积比为1:1-2；所述试剂1为：10～100mmol/L缓冲液、10～50mmol/LMgCl2、10～50mmol/LKCl、10～200mmol/LNaCl、1～50mmol/LS-腺苷甲硫氨酸、0.1～10mmol/LNADP+、0.1～200g/L保护剂；所述的试剂2为：10～100mmol/L缓冲液、1～1000U/L组胺-N-甲基转移酶1～1000U/LS-腺苷同型半胱氨酸水解酶、1～1000U/L腺嘌呤核苷酶、1～1000U/L核糖-1-脱氢酶、0.1～200g/L保护剂。在一些具体实施例中，所述试剂1和试剂2的缓冲液各自独立地选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，且所述试剂1和试剂2的pH相同。在一些具体实施例中，所述的试剂1和试剂2的保护剂各自独立地选自甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、甘露醇、蔗糖、壳聚糖、灭活的胎牛血清、叠氮钠、吐温、曲拉通X-100中的一种或多种。在一些具体实施例中，酱油或醋样品中组胺的脱色方法是，取一定量的样品溶液，加入50～200mg氧化石墨烯，振荡混匀1～5min，离心(5000～10000r/min)5～10min，收集上清液，备用检测。进一步地，本专利技术针利用四种酶偶联反应，提供一种可以定量检测酱油和醋等食品中组胺的方法与试剂盒，反应原理如图1所示。在一些实施方式中，一种上述基于酶偶联法的检测酱油和醋等食品中组胺的试剂盒，具体为：该试剂盒由试剂1和试剂2组成，其中：试剂1为：10～100mmol/L缓冲液10～50mmol/LMgCl210～50mmol/LKCl10～200mmol/LNaCl1～50mmol/LS-腺苷甲硫氨酸0.1～10mmol/LNADP+0.1～200g/L保护剂；试剂2为：10～100mmol/L缓冲液1～1000U/L组胺-N-甲基转移酶1～1000U/LS-腺苷同型半胱氨酸水解酶1～1000U/L腺嘌呤核苷酶1～1000U/L核糖-1-脱氢酶0.1～200g/L保护剂。在一些具体实施例中，所述试剂1和试剂2的缓冲液各自独立地选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，且所述试剂1和试剂2的pH相同。在一些具体实施例中，，所述的试剂1和试剂2的保护剂各自独立地选自甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、甘露醇、蔗糖、壳聚糖、灭活的胎牛血清、叠氮钠、吐温、曲拉通X-100中的一种或多种。试剂1和试剂2中的溶剂均为蒸馏水，按常规方法配置。本专利技术提供的组胺检测方法操作简单，不需要使用大型仪器，检测结果稳定可靠、重现性好；试剂盒既可在普通分光光度计上使用，也可以应用于高通量检测的全自动生化分析仪，非常适合于中小型生产企业及基层使用。附图说明图1为酶偶联法测定组胺原理图；图2为组胺测定标准曲线图。具体实施方式下面结合实施例进一步阐述本专利技术，但不是对本专利技术的限制。实施例1试剂1为：50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.620mmol/LMgCl220mmol/LKCl50mmol/LNaCl5mmol/LS-腺苷甲硫氨酸1mmol/LNADP+1g/L叠氮钠10g/L吐温20试剂2为：50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.6200U/L组胺-N-甲基转移酶100U/LS-腺苷同型半胱氨酸水解酶100U/L腺嘌呤核苷酶100U/L核糖-1-脱氢酶10g/L甘露醇10g/L灭活的胎牛血清10g/L曲拉通X-1001g/L叠氮钠上述试剂盒用于酱油和醋中组胺的酶偶联分析检测技术，具体过程为：样品中的组胺经脱色后，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，经组胺-N-甲基转移酶催化，生成t-甲基组胺和S-腺苷同型半胱氨酸，后者再经S-腺苷同型半胱氨酸水解酶迅速转化成同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷。腺嘌呤核苷再经腺嘌呤核苷酶作用，水解成腺嘌呤和核糖，而核糖迅速被核糖-1-脱氢酶氧化，生成核糖酸和NADPH。利用NADPH在340nm有吸收峰，测定吸光度值，通过组胺标准曲线，可以得到样品中组胺的含量。具体的实施步骤为：取5.0mL酱油或醋样品溶液到10mL离心管中，加入200mg氧化石墨烯，振荡混匀3min，离心(10000r/min)5min，收集上清液，为待测溶液。取2.0mL待测溶液入试管中，加入2.0mL蒸馏水，混匀。加入100uL试剂1，混匀，再加入100uL试剂2，混匀，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酱油和醋中组胺的酶偶联检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：/n(1)样品经氧化石墨烯脱色；/n(2)由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，经组胺-N-甲基转移酶催化，生成t-甲基组胺和S-腺苷同型半胱氨酸；/n(3)S-腺苷同型半胱氨酸经S-腺苷同型半胱氨酸水解酶迅速转化成同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷；/n(4)腺嘌呤核苷经腺嘌呤核苷酶作用，水解成腺嘌呤和核糖，而核糖迅速被核糖-1-脱氢酶氧化，生成核糖酸和NADPH；/n(5)利用NADPH在340nm有吸收峰，在340nm处测定吸光度值，通过组胺标准曲线，可以确定样品中组胺的含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种酱油和醋中组胺的酶偶联检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)样品经氧化石墨烯脱色；
(2)由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，经组胺-N-甲基转移酶催化，生成t-甲基组胺和S-腺苷同型半胱氨酸；
(3)S-腺苷同型半胱氨酸经S-腺苷同型半胱氨酸水解酶迅速转化成同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷；
(4)腺嘌呤核苷经腺嘌呤核苷酶作用，水解成腺嘌呤和核糖，而核糖迅速被核糖-1-脱氢酶氧化，生成核糖酸和NADPH；
(5)利用NADPH在340nm有吸收峰，在340nm处测定吸光度值，通过组胺标准曲线，可以确定样品中组胺的含量。


2.根据权利要求1所述的酶偶联检测方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：取酱油或醋样品溶液到离心管中，加入氧化石墨烯，振荡混匀，离心收集上清液，为待测溶液；取待测溶液入试管中，加入蒸馏水，混匀；加入试剂1，混匀，再加入试剂2，混匀，于37℃水浴中保温反应10min，于分光光度计中340nm测定吸光度值；根据标准曲线和稀释倍数计算出样品中组胺含量；
其中，所述的试剂1与试剂2的体积比为1:1-2；所述试剂1为：10～100mmol/L缓冲液、10～50mmol/LMgCl2、10～50mmol/LKCl、10～200mmol/LNaCl、1～50mmol/LS-腺苷甲硫氨酸、0.1～10mmol/LNADP+、0.1～200g/L保护剂；
所述的试剂2为：10～100mmol/L缓冲液、1～1000U/L组胺-N-甲基转移酶1～1000U/LS-腺苷同型半胱氨酸水解酶、1～1000U/L嘌呤核苷酶、1～1000U/L核糖-1-脱氢酶、0.1～200g/L保护剂。


3.根据权利要求2所述的酶偶联检测方法，其特征在于，所述试剂1和试剂2的缓冲液各自独立地选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，且所述试剂1和试...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯纬，周利南，黄光荣，刘晔，沈权锋，沈海锋，杨慧，
申请(专利权)人：浙江五味和食品有限公司，杭州市食品酿造有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33