一种快速高效的芝麻毛状根遗传转化体系的建立方法技术

本发明专利技术提供一种快速高效的芝麻毛状根遗传转化体系的建立方法。其利用芝麻无菌苗子叶进行外植体转化，包括以下步骤：(1)培养得到芝麻无菌苗；(2)外植体转化：在无菌芝麻苗离体子叶上产生伤口，得到外植体，然后利用发根农杆菌菌液侵染，置于共培养基上共培养；(3)外植体抑菌及毛状根诱导：将上述共培养的外植体用含有抑菌剂的清洗培养基清洗然后转入诱导生根和继代培养基上培养，诱导生根和继代培养基中添加有抑菌剂；(4)芝麻毛状根继代增殖培养将上述获得的诱导培养生长至12‑14d的毛状根从子叶上切下，接种到相同的无激素的诱导生根和继代培养基上继续扩大培养。本发明专利技术方法培养简单、再生周期短、可持续获得芝麻转基因毛状根。

【技术实现步骤摘要】
一种快速高效的芝麻毛状根遗传转化体系的建立方法
本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种快速高效的芝麻毛状根遗传转化体系的建立方法。
技术介绍
芝麻(SesamumindicumL.)属胡麻科，在世界许多热带和亚热带地区广泛栽培和利用的优质油料和特色经济作物，许多进化论工作者都认为芝麻是人类最古老的油料作物之一。芝麻在世界各地都有种植，主要生产国包括中国、印度、韩国、土耳其以及南美洲、拉丁美洲和非洲等国家。芝麻在我国栽培历史悠久，长达2100多年，其富含不饱和脂肪酸、维生素E、甾醇、芝麻素等功能保健物质，具有食用、保健、医药等多种用途，特别是小磨香油、芝麻酱深受我国消费者喜爱。芝麻易受到一系列生物和非生物逆境的影响，从而影响作物的产量潜力，由于野生芝麻和栽培芝麻的杂交不亲和，所以想利用野生亲缘关系将理想性状导入栽培品种是非常困难的，通过现代植物育种改良作物是克服阻碍芝麻产量提升的重要手段之一。芝麻之所以很少受到生物技术和现代分子生物学领域的关注，部分原因是难以建立一个可靠的遗传转化体系。芝麻是一种难以再生的植物，在过去的40年里，人们一直致力于从不同的外植体来源获得再生的植株，包括成熟胚、未成熟胚、未成熟子叶、从种子中直接切下的子叶、从萌发的幼苗中切下的子叶、下胚轴、茎尖和根段等有不同程度的成功，但植株再生率都非常的低。此外，重要的是芝麻的成功再生植株是高度基因型依赖的，利用其它基因型很难进行重复。有关芝麻遗传转化的报道非常的少，且很少获得再生的转基因植株，转基因阳性率非常的低且不稳定。因此，当前急需构建一种高效的芝麻遗传转化体系为芝麻各类基因的功能验证提供技术支持。经文献查询，国内外尚没有芝麻毛状根培养体系建立相关的专利技术或非专利文献公开或使用。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种周期短，遗传转化率高，毛状根生长速度快的芝麻毛状根遗传转化体系建立方法。本专利技术主要涉及利用芝麻无菌苗的子叶为外植体，利用发根农杆菌介导，建立芝麻毛状根培养体系的方法。一种快速高效的芝麻毛状根遗传转化体系的建立方法，包括以下步骤：(1)培养得到芝麻无菌苗；(2)外植体转化在无菌芝麻苗离体子叶上产生伤口，得到外植体，然后利用发根农杆菌菌液侵染，置于共培养基上共培养，发根农杆菌菌液的浓度为：OD600为0.6-0.8；(3)外植体抑菌及毛状根诱导将上述共培养的外植体用含有抑菌剂的清洗培养基清洗，然后转入诱导生根和继代培养基上培养，诱导生根和继代培养基中添加有抑菌剂；(4)芝麻毛状根继代增殖培养将上述获得的诱导培养生长至12-14d的毛状根从子叶上切下，接种到诱导生根和继代培养基(和前述相同)上继续扩大培养。按上述方案，步骤(1)为将芝麻种子预先灭菌处理，将灭菌后的芝麻种子接种到芝麻生长培养基上培养，所述的无菌芝麻种子生长培养基为：MS(NH4NO31650mg/L+KNO31900mg/L+CaCl2·2H2O440mg/L+MgSO4·7H2O370mg/L+KH2PO4170mg/L+KI0.83mg/L+H3BO36.2mg/L+MnSO4·4H2O22.3mg/L+ZnSO4·7H2O8.6mg/L+Na2MoO4·2H2O0.25mg/L+CuSO4·5H2O0.025mg/L+CoCl2·6H2O0.025mg/L+Na2EDTA37.25mg/L+FeSO4·7H2O27.85mg/L+肌醇100mg/L+甘氨酸2mg/L+盐酸硫胺素0.1mg/L+盐酸吡哆醇0.5mg/L+烟酸0.5mg/L)+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+0.075％PPM，pH5.8培养基，培养条件28±2℃、16/8h(光照16h，黑暗8h)光周期培养，培养时间7-10d，获得芝麻的无菌苗。采用生长7-10d的芝麻无菌苗的子叶为外植体进行遗传转化，操作简单方便，可以避免外植体不易灭菌、灭菌不彻底带来的污染以及外植体易于获得，7-8d便可以从子叶柄伤口以及子叶伤口边缘诱导出毛状根，再生速度快。按上述方案，步骤(2)中取培养7-10d的无菌芝麻苗子叶切2-3个伤口进行发根农杆菌菌液侵染，伤口大小5-10mm。按上述方案，步骤(2)中发根农杆菌培养至OD600值于1.1-1.8之间，之后用重悬培养基(MS液体培养基)重悬至OD600值为0.6-0.8；或者培养至OD600值为0.6-0.8直接用于子叶外植体的侵染。按上述方案，步骤(2)中发根农杆菌为发根农杆菌K599。按上述方案，步骤(2)的浸染时间为10-15min。按上述方案，步骤(2)的共培养基为：1/10MS(NH4NO3165mg/L+KNO3190mg/L+CaCl2·2H2O44mg/L+MgSO4·7H2O37mg/L+KH2PO417mg/L+KI0.83mg/L+H3BO36.2mg/L+MnSO4·4H2O22.3mg/L+ZnSO4·7H2O8.6mg/L+Na2MoO4·2H2O0.25mg/L+CuSO4·5H2O0.025mg/L+CoCl2·6H2O0.025mg/L+Na2EDTA37.25mg/L+FeSO4·7H2O27.85mg/L+肌醇100mg/L+甘氨酸2mg/L+盐酸硫胺素0.1mg/L+盐酸吡哆醇0.5mg/L+烟酸0.5mg/L)+蔗糖30g/L+MES(吗啉乙磺酸)3.9g/L+琼脂8g/L+DTT(二硫苏糖醇)150mg/L+AS(乙酰丁香酮)0.02g/L，pH5.4。按上述方案，步骤(3)所述的清洗培养基清洗步骤为：用清洗培养基清洗3次，每次1min至培养基清澈，然后置于无菌滤纸上自然吹干至子叶表面无明显水分；所述的清洗培养基为MS+蔗糖30g/L+噻孢霉素200-250mg/L+羧苄青霉素200-250mg/L，pH5.8。按上述方案，诱导生根和继代培养基为1/2MS(NH4NO3825mg/L+KNO3950mg/L+CaCl2·2H2O220mg/L+MgSO4·7H2O185mg/L+KH2PO485mg/L+KI0.83mg/L+H3BO36.2mg/L+MnSO4·4H2O22.3mg/L+ZnSO4·7H2O8.6mg/L+Na2MoO4·2H2O0.25mg/L+CuSO4·5H2O0.025mg/L+CoCl2·6H2O0.025mg/L+Na2EDTA37.25mg/L+FeSO4·7H2O27.85mg/L+肌醇100mg/L+甘氨酸2mg/L+盐酸硫胺素0.1mg/L+盐酸吡哆醇0.5mg/L+烟酸0.5mg/L)+蔗糖30g/L+MES0.6g/L+琼脂7g/L+特美汀200mg/L，pH5.8。按上述方案，步骤(3)所述的培养条件为28±2℃、16/8h光周期条件下抑菌并诱导生根，培养7-8d后子叶上就能长出毛状根。本专利技术以芝麻无菌苗子叶为外植体，通过对外源生长调节物质，各培养基的组成，子叶生长状态，共培养时间，菌液浓度，侵染时间，抑菌剂的加入等条件摸索本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速高效的芝麻毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)培养得到芝麻无菌苗/n(2)外植体转化/n在无菌芝麻苗离体子叶上产生伤口，得到外植体，然后利用发根农杆菌菌液侵染，置于共培养基上共培养，发根农杆菌菌液的浓度为：OD

【技术特征摘要】
1.一种快速高效的芝麻毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)培养得到芝麻无菌苗
(2)外植体转化
在无菌芝麻苗离体子叶上产生伤口，得到外植体，然后利用发根农杆菌菌液侵染，置于共培养基上共培养，发根农杆菌菌液的浓度为：OD600为0.6-0.8；
(3)外植体抑菌及毛状根诱导
将上述共培养的外植体用含有抑菌剂的清洗培养基清洗然后转入诱导生根和继代培养基上培养，诱导生根和继代培养基中添加有抑菌剂；
(4)芝麻毛状根继代增殖培养
将上述获得的诱导培养生长至12-14d的毛状根从子叶上切下，接种到与前述相同的诱导生根和继代培养基上继续扩大培养。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)为将：芝麻种子预先灭菌处理，将灭菌后的芝麻种子接种到芝麻生长培养基上培养，所述的无菌芝麻种子生长培养基为：NH4NO31650mg/L+KNO31900mg/L+CaCl2·2H2O440mg/L+MgSO4·7H2O370mg/L+KH2PO4170mg/L+KI0.83mg/L+H3BO36.2mg/L+MnSO4·4H2O22.3mg/L+ZnSO4·7H2O8.6mg/L+Na2MoO4·2H2O0.25mg/L+CuSO4·5H2O0.025mg/L+CoCl2·6H2O0.025mg/L+Na2EDTA37.25mg/L+FeSO4·7H2O27.85mg/L+肌醇100mg/L+甘氨酸2mg/L+盐酸硫胺素0.1mg/L+盐酸吡哆醇0.5mg/L+烟酸0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7-8g/L+0.075％PPM，pH5.8培养基，培养条件28±2℃、16/8h光周期培养，培养时间7-10d，获得芝麻的无菌苗。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中取培养7-10d的无菌芝麻苗子叶切2-3个5-10mm伤口进行发根农杆菌菌液侵染。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中发根农杆菌培养至OD600值于1.1-1.8之间，之后用重悬培养基(MS液体培养基)重悬至OD600值为0.6-0.8；或者培养至OD600值为0.6-0.8直接用于子叶外植体的侵染。


5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中发根农杆菌为发根农杆菌K599。


6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)的浸染时间为10-15min。


7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)的共培养基为：NH4NO3165mg/L+KNO3190mg/L+CaCl2·2H2O44mg/L+MgSO4·7H2O37mg/L+KH2PO417m...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎冬华，游均，魏梦园，刘爱丽，苏如其，山姆，周瑢，张秀荣，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42