检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法技术

本发明专利技术公开了一种检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法。成年SD大鼠睾丸生精小管相关的干细胞，称为Leydig干细胞(SLC)，能够在体外和体内分化为Leydig细胞。SLC的增殖和分化受局部产生的因子调节，包括PDGF家族成员PDGF‑AA和PDGF‑BB。两个成员都能够刺激SLC的增殖，而只有PDGF‑AA能够刺激SLC分化为产生睾酮素(T)的Leydig细胞，而PDGF‑BB则抑制该过程。在本方法中，验证了SLC实际上在不同分化条件下，能够形成Leydig细胞或肌样细胞。PDGF‑AA+LH可以让SLC分化为产生T的Leydig细胞，PDGF‑BB+TGFB则诱导细胞成为表达平滑肌肌动蛋白的类肌细胞。本方法有效验证了生精小管相关干细胞(SLC)的多能性，并且检验了SLC在体内维持Leydig和Myoid群体的体内稳态的重要作用。

【技术实现步骤摘要】
检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法
本专利技术涉及生物化学试验
，具体是一种检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法。
技术介绍
哺乳动物的睾丸既有生殖细胞，又有体细胞。生殖细胞群体产生精子，而体细胞群体会产生雄性激素睾酮(T)并为精子的产生提供支持。间质Leydig细胞和生精小管周围的肌样myoid细胞是睾丸的两个重要组成部分。睾丸间质细胞的主要功能是产生T，这对于维持睾丸的精子产生和机体的雄性性别特征至关重要。Leydig细胞发育或维持的缺陷可能会导致雄性激素缺乏症(性腺功能减退)，从而影响个体的生殖功能以及个体身心健康。性腺机能减退与许多生理和心理变化有关，包括身体瘦弱、骨密度低、肌肉质量和力量下降以性欲下降，并且还会引发腹部肥胖、心血管疾病、情绪低迷等情况。然而，肌样myoid细胞是位于生精小管周围的一组平滑肌细胞，它们为生精小管结构提供物理支持，并通过其可收缩性帮助小管腔内精子的运动。肌样细胞的雄性激素受体表达，已被证明对睾丸功能至关重要，现有研究证实肌细胞特异性雄性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一，试验动物的处理：选用90天雄性SD大鼠，向所述SD大鼠腹腔内注射乙烯二甲基磺酸盐(EDS，80mg/kg体重)，经EDS处理后四天，通过麻醉处死SD大鼠；/n步骤二，生精小管的分离与培养：将去白膜睾丸组织置于DMEM/F12培养基中，在透射照明解剖显微镜下，将生精小管与间质组织机械分离，等长截取5cm的生精小管，在生精小管培养基中培养，在34℃和5％CO

【技术特征摘要】
1.一种检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，试验动物的处理：选用90天雄性SD大鼠，向所述SD大鼠腹腔内注射乙烯二甲基磺酸盐(EDS，80mg/kg体重)，经EDS处理后四天，通过麻醉处死SD大鼠；
步骤二，生精小管的分离与培养：将去白膜睾丸组织置于DMEM/F12培养基中，在透射照明解剖显微镜下，将生精小管与间质组织机械分离，等长截取5cm的生精小管，在生精小管培养基中培养，在34℃和5％CO2下长达4周，所述生精小管培养基包含有LH(10ng/ml)或PDGF-AA(10ng/ml)或PDGF-BB(10ng/ml)或TGFB(10ng/ml)中一种或多种试剂，在实验结束时，收集培养基并在-20℃条件下冷冻，对部分生精小管进行HSD3B活性染色或固定以进行CYP11A1、desmin、ACTA2或层粘连蛋白免疫荧光染色，对剩余生精小管-80℃冷冻保存以用于蛋白质印迹；
步骤三，SLCs的分化与增殖：设置第一周时间为增殖期，设置第二至四周时间为分化期。在增殖期中，除添加PDGF-AA或PDGF-BB外，不添加其它试剂。在分化期中，含有LH(10ng/ml)及PDGF-AA(10ng/ml)的培养基用于Leydig细胞的培育，含有TGFB(10ng/ml)及PDGF-BB(10ng/ml)的培养基用于肌样细胞的培育，并用Click-iTEdU试剂盒标记生精小管表面的分裂细胞。将部分用PDGF-AA(10ng/ml)或PDGF-BB(10ng/ml)处理6天后的生精小管用EdU(10μM)标记24小时，在荧光显微镜下观察生精小管表面的Click-iT阳性细胞，并定量计数。沿生精小管表面计数阳性细胞数量，以每平方单位表达阳性细胞数；将另一部分用EdU标记的生精小管固定在10％福尔马林中，保持15min后，包埋在石蜡中并切片，在完成EdU标记后，用层粘连蛋白抗体对切片后的生精小管的基底膜复染，对生精小管进行了CYP11A1和/或HSD3B染色以测量Leydig细胞谱系的分化，对生精小管进行结蛋白或ACTA2染色以确定肌样细胞谱系的分化；
步骤四，免疫荧光和HSD3B活性染色：在EDS处理后的第7天，检查SD大鼠睾丸细胞的PDGFRα和PDGFRβ的表达，将SD大鼠睾丸用福尔马林固定并包埋在石蜡中，用含0.5％BSA的无Ca2+/Mg2+的HBSS洗涤生精小管以及睾丸切片，然后与一抗培育60min，再与二抗培育30min；然后用荧光二抗处理组织1小时，清洗后，用尼康Eclipse800显微镜检查组织，并用普林斯顿仪器5-MhzcooledCCd相机拍摄，制作CRI彩色滤光片并用IP-实验室数字图像分析软件进行分析，对生精小管中HSD3B进行酶染色；
步骤五，蛋白质印记分析：用Tris-HCl缓冲液，以裂解组织或细胞，在18...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈浩林，管小菊，林函，段萍，吴越，赵星星，温馨，季敏鹏，陈丹，赵星仪，黄福，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院，温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33