【技术实现步骤摘要】
检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法
本专利技术涉及生物化学试验
，具体是一种用于检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化，促进其向脂肪细胞分化的方法。
技术介绍
邻苯二甲酸酯是一组合成化学物质，广泛应用于消费品和工业环境，具体包括医疗设备、食品包装、家具、服装、清洁材料和汽车等产品。目前通过医学研究发现，邻苯二甲酸酯的使用可能会引发男性生殖系统疾病，例如隐睾症、尿道下裂、精液质量变差等，甚至会引发睾丸癌，这些症状被统称为睾丸发育不全综合征。在体内，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯(DEHP)会被快速代谢为邻苯二甲酸单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯(MEHP)，MEHP被认为是影响体内生殖功能的主要形式。在雄性生殖系统中，MEHP的主要靶标是Leydig细胞。并且在实验动物研究中发现，在妊娠期或青春期接触DEHP会显著影响胎儿和成年Leydig细胞的发育。但是，目前邻苯二甲酸盐影响Leydig细胞发育的机制知之甚少，尤其是MEHP是否直接作用于正在发育的Leydg干细胞(SLCs...
【技术保护点】
1.一种用于检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞分化功能的方法，其特征包括以下步骤：/n步骤一，试验动物的处理：选用90天雄性SD大鼠，向所述大鼠腹腔注射一针乙烯二甲基磺酸盐(Ethylene dimethanesulfonate：EDS，80毫克/公斤体重)，四天后从所述SD大鼠睾丸中分离生精小管和SLCs；/n步骤二，生精小管的培养与处理：将生精小管分成多组，并添加不同浓度(0-100μM)的MEHP，在34℃和5％CO2的条件下培养生精小管4周；在第一周末，于部分生精小管培养基中加入10μM EdU标记24小时，检测细胞增殖活性；显微镜下计数生精小管表面阳性细胞，并表示为每...
【技术特征摘要】
1.一种用于检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞分化功能的方法，其特征包括以下步骤：
步骤一，试验动物的处理：选用90天雄性SD大鼠，向所述大鼠腹腔注射一针乙烯二甲基磺酸盐(Ethylenedimethanesulfonate：EDS，80毫克/公斤体重)，四天后从所述SD大鼠睾丸中分离生精小管和SLCs；
步骤二，生精小管的培养与处理：将生精小管分成多组，并添加不同浓度(0-100μM)的MEHP，在34℃和5％CO2的条件下培养生精小管4周；在第一周末，于部分生精小管培养基中加入10μMEdU标记24小时，检测细胞增殖活性；显微镜下计数生精小管表面阳性细胞，并表示为每平方单位的阳性细胞数目；其它的生精小管，继续培养至第四周末，行HSD3B酶活性染色，以检测MEHP对小管表面的SLCs分化成Leydig细胞的影响，或抽提蛋白，进行WesternBlots(WB)分析Leydig细胞相关蛋白表达；
步骤三，CD90+SLCs的培养和处理：以步骤二获取生精小管行胶原酶处理得单细胞悬液，然后行流式分选，获取CD90+SLCs。体外扩增CD90+SLCs，采用用不同浓度(0-100μM)的MEHP处理7天，再加入10μMEdU标记24小时，显微镜下计数EdU阳性及DAPI染色的总细胞核并计算阳性率；其它细胞继续培养，铺满度达到90％时，将其置于Leydig细胞分化诱导培养基(LIM)或脂肪细胞诱导培养基(AIM)中，同时添加不同浓度(0-100μM)的MEHP3周；实验完成后，对细胞进行HSD3B活性及Oil-RedO染色，阳性细胞计数；另外，以qPCR分析Leydig细胞基因及成脂基因表达情况，以评估MEHP对SLCs分化成Leydig谱系及脂肪细胞谱系的影响。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈浩林，管小菊，郝心蕊，陈盼盼，赵星星，季敏鹏，温馨，黄福，汪捷遐，赵星仪，陈丹，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院，温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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