一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其能通过对发酵方法的各工艺步骤、参数条件以及培养基配制进行综合优化，以提高外源蛋白的表达水平。一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、在生长温度条件下培养大肠杆菌，生长温度为30‑37℃；步骤2、待细胞密度在OD

【技术实现步骤摘要】
一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法
本专利涉及蛋白异源表达
，具体涉及一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法。
技术介绍
基于大肠杆菌的原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达产物分离纯化相对简单等优点。目前大肠杆菌表达体系主要通过大肠杆菌菌株的自然筛选或基因改造、载体构建或元件优化以提高外源蛋白的表达水平，但对大肠杆菌发酵培养方法的优化控制却鲜有提及，因此，提供一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，通过对发酵方法的各工艺步骤、参数条件以及培养基配制进行综合优化，以提高外源蛋白的表达水平，是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其能通过对发酵方法的各工艺步骤、参数条件以及培养基配制进行综合优化，以提高外源蛋白的表达水平。其技术方案是这样的，一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、在生长温度条件下培养大肠杆菌(转化有重组蛋白相应载体的大肠杆菌)，所述生长温度为30-37℃；步骤2、待细胞密度在OD600条件下达到40±5时，转为诱导温度下培养大肠杆菌，所述诱导温度为20-35℃，所述诱导温度低于所述生长温度；步骤3、在诱导温度下培养0.5-2h后加入诱导剂进行诱导；所述步骤1中，首先采用基础培养基培养大肠杆菌，待反应器中甘油耗尽，溶解氧浓度上升并达到峰值时，添加补料培养基，补料速度为1-10mL/(h·L)（每升培养基每小时流加1-10mL补料培养基）；所述基础培养基包括酵母蛋白胨5-15g/L，酵母浸出物10-25g/L，甘油5-10g/L，磷酸二氢钾1.3-2.0g/L，磷酸氢二钾4.5-8.0g/L，氯化钙0.1-0.3g/L，氯化镁1-4g/L，氯化钴0.002-0.01g/L，硫酸铁0.15-0.5g/L，硫酸锌0.02-0.05g/L，钼酸钠0.01g/L；所述补料培养基包括甘油10-300g/L，硫酸铵5-10g/L，氯化铵5-10g/L。进一步的，所述基础培养基、所述补料培养基中的甘油由半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖中的一种以上替代，或者，甘油由甘油、半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖中的两种以上替代。进一步的，所述诱导剂包括但不限于IPTG、乳糖、阿拉伯糖、色氨酸。进一步的，所述重组蛋白包括但不限于VLP（病毒样颗粒）、抗体、多肽、酶制剂。进一步的，所述大肠杆菌为自然筛选菌种或基因改造后的工程菌，包括但不限于BL21、W3110、DH5α。本专利技术的方法，通过碳源筛选及控制、阶段变温、补料控制、补料培养基控制、诱导控制、溶解氧控制，微量元素控制等以及以上的多方式组合，提高外源蛋白表达量；具体的，在碳源筛选及控制上，以甘油、半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖中的一种或多种作为主要碳源，相对于以葡萄糖为主要碳源，可有效降低代谢副产物-乙酸的产生，减缓乙酸对大肠杆菌生长的抑制作用；在补料与阶段变温的控制上，通过当甘油耗尽时进行补料，待细胞生长至对数期降低细胞培养温度，并调节补料培养基流加速度，调节大肠杆菌的生长速度与代谢流，采用此表达调控，可有效地延长大肠杆菌培养周期，提高大肠杆菌的细胞密度，同时实现较高的蛋白表达量。附图说明图1是传统方式（以葡萄糖为主要碳源）利用大肠杆菌进行蛋白异源表工艺以及大肠杆菌生长曲线。图2是传统方式（以葡萄糖为主要碳源）诱导后大肠杆菌比生长速率。图3是采用本专利技术的进行VLP表达的工艺以及大肠杆菌生长曲线。图4是采用本专利技术的诱导后大肠杆菌比生长速率。图5是采用本专利技术的进行VLP表达的SDS-PAGE图。图6是采用本专利技术的进行ScFv表达的工艺以及大肠杆菌生长曲线。图7是采用本专利技术的诱导后大肠杆菌比生长速率。图8是采用本专利技术的进行ScFv表达的SDS-PAGE图。图9是采用本专利技术的进行普鲁兰酶表达的工艺以及大肠杆菌生长曲线。图10是采用本专利技术的诱导后大肠杆菌比生长速率。图11是采用本专利技术的进行普鲁兰酶表达的SDS-PAGE图。图12是诱导后大肠杆菌比生长速率与蛋白表达产量图。具体实施方式实施例1：利用本专利技术的方法进行VLP的表达1.将SARS-CoV-2的S蛋白的核酸序列（NCBI，GeneID:43740568，如SEQIDNO：1所示）由苏州金唯智生物科技有限公司合成，经BglII酶（NEB公司）与BamHI酶（NEB公司）双酶切后通过T4连接酶（NEB公司）连接于pET-22b(+)质粒（Novagen公司），构建表达质粒pET-22b(+)-S，将该质粒化转大肠杆菌BL21菌株（中国高校工业微生物资源与信息中心），即得到表达菌株，表达菌株需要加入IPTG诱导剂启动转录与翻译。2.按照表1与表2中培养基配方配制1L基础培养基与200mL补料培养基。将基础培养基装入反应器（Applikon5L反应器）内，将补料培养基装入补料瓶中。pH电极与DO电极以及其他管路安装完成后置于灭菌锅中高温高压锅中灭菌（121℃，20min）。3.灭菌结束后将反应器与控制器相连接，启动温度控制（温度设置为37℃），将空气进气量设置为1vvm（每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值）。不接菌种空置培养一天通过无菌检验后进行后续操作。4.启动pH控制与DO控制，将pH设置为7.0，将DO设置为30%。将经过摇瓶过夜活化后（OD600=3-5）的大肠杆菌种子液按照0.5%比例接种（接种终OD600=0.05-0.3）至反应器中。5.待反应器中甘油耗尽时，溶解氧浓度上升，出现DO峰，启动补料，补料速度为20mL/h。6.待细胞密度（OD600）达到40±5℃时，将反应器温度由37℃更改为23℃，继续培养1h。7.向反应器中加入终浓度为0.5mM的IPTG（诱导剂），继续培养24h。8.待发酵结束后，收获培养基并离心去除上清。菌体经PBS溶液重悬后进行高压匀浆，并经过12000rpm离心后取上清测定VLP滴度。另取适量上清进行SDS-PAGE分析。9.VLP滴度采用新冠病毒S蛋白酶联免疫（ELISA）试剂盒（北京义翘神州科技有限公司）进行测定，具体操作参考试剂盒说明书，滴度以mg/L表示。10.过程工艺以及大肠杆菌生长曲线如图2所示，SDS-PAGE结果如图3所示。由于大肠杆菌发酵的传统方式以葡萄糖作为培养基中的主要碳源（例如《重组大肠杆菌的高密度培养及在丙谷二肽生产中的应用》，DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023810；《大肠杆菌工程菌高密度发酵生产虾青素》，DOI：10.27103/d.cnki.ghebu.2020.001037）等），本专利中以传统方式作为实验对照组。由实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1、在生长温度条件下培养大肠杆菌，所述生长温度为30-37℃；/n步骤2、待细胞密度在OD

【技术特征摘要】
1.一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、在生长温度条件下培养大肠杆菌，所述生长温度为30-37℃；
步骤2、待细胞密度在OD600条件下达到40±5℃时，转为诱导温度下培养大肠杆菌，所述诱导温度为20-35℃，所述诱导温度低于所述生长温度；
步骤3、在诱导温度下培养0.5-2h后加入诱导剂进行诱导；
所述步骤1中，首先采用基础培养基培养大肠杆菌，待反应器中甘油耗尽，溶解氧浓度上升并达到峰值时，添加补料培养基，补料速度为1-10mL/h·L（每升培养基每小时流加1-10mL补料培养基）；
所述基础培养基包括酵母蛋白胨5-15g/L，酵母浸出物10-25g/L，甘油5-10g/L，磷酸二氢钾1.3-2.0g/L，磷酸氢二钾4.5-8.0g/L，氯化钙0.1-0.3g/L，氯化镁1-4g/L，氯化钴0.002-0.01g/L，硫酸铁0.15-0.5g/L，硫酸锌0.02-0.05g/L，钼酸钠0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙杨，聂简琪，白仲虎，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32