本发明专利技术公开了新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术将新型冠状病毒S蛋白的ECD、S1亚基和RBD分别与铁蛋白亚基N端融合表达展示在自组装铁蛋白笼形结构表面。本发明专利技术进一步将S蛋白进行突变优化以提高其可溶性表达量和表达效率，提高疫苗的免疫效力与宽度并有效提高免疫原性。本发明专利技术利用大肠杆菌原核表达系统、家蚕及AcMNPV‑昆虫细胞真核表达系统分别表达重组蛋白疫苗或通过重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行基因呈递产生抗原诱导抗体产生。本发明专利技术新冠疫苗能引发广泛中和性抗新冠抗体，不仅可提高免疫效力还能扩大免疫范围，具有成为一种具有交叉免疫效力的通用新冠疫苗的潜力。
【技术实现步骤摘要】
新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒，尤其涉及包含由新冠病毒S蛋白和单体铁蛋白亚基融合在一起的纳米抗原颗粒以及由该纳米颗粒抗原制备的新冠疫苗，属于新冠疫苗领域。
技术介绍
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的新发呼吸道病原体，与中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)同属β-冠状病毒。SARS-CoV-2主要通过呼吸系统和消化系统感染，具有较高的传染性和致死率，其临床表现从轻微的流感样症状到严重危及生命的重症肺炎。新冠病毒与其他冠状病毒类似，由四个结构蛋白组成，分别是刺突蛋白(spike，S)、包膜蛋白(envelope，E)、膜蛋白/基质蛋白(membrane/matrix，M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)。S蛋白通过位于S1亚基上的受体结合区(receptorbingdingdomain，RBD)与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2受体结合，从而进入人体细胞，导致发烧、肺部感染等疾病。因为针对病毒S蛋白的中和抗体可阻断病毒侵入宿主细胞，所以目前在研究的大多数新冠疫苗都是以S蛋白为主要抗原进行设计开发的。新冠病毒引起的肺炎已在全球范围内大规模蔓延，接种疫苗是根除病毒性传染病最有效的方法，国内外各大科研机构已快速展开COVID-19疫苗的研制工作。近几年，铁蛋白作为一个理想的抗原呈递和疫苗开发平台发展迅速，铁蛋白纳米粒子由24个亚基自组装而成，每三个亚基构成一个三聚体。因为N端暴露在笼形结构外面，常用来在N端融合表达并展示外源蛋白。同时，SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白也是一个三聚体结构，S-Ferritin融合蛋白组装后可以在纳米颗粒表面产生一个八元S蛋白三聚体刺突，在结构上很好的模拟了SARS-CoV-2S蛋白天然结构，从而使得S蛋白抗原性更好。铁蛋白纳米颗粒广泛存在于所有生物体内，是生物体内的主要储铁形式，对生命活动非常重要。铁蛋白非常稳定，能够耐受高温(70％-80％)和多种变性剂而不影响其天然蛋白结构。利用铁蛋白这些独特的理化性质，仿生合成铁蛋白并使其成为理想的纳米载体。铁蛋白作为纳米载体具有较大表面积和较为简单的表面修饰方法，能够高效率、高精度地装载药物分子。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种包含新冠病毒S蛋白融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒；本专利技术的目的之二是将所述融合蛋白进行突变进而提高融合蛋白的表达量或表达效率；本专利技术目的之三是提供高效表达所述融合蛋白的方法；本专利技术目的之四是提供一种将自组装铁蛋白纳米颗粒与新冠病毒S蛋白所构建的融合基因呈递给动物体内并在动物体内呈递抗原诱导产生抗体的方法。本专利技术的目的之五是提供基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒得到的纳米颗粒新冠疫苗；为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先提供了一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，所述融合蛋白由新冠病毒S蛋白和单体铁蛋白亚基连接得到；优选的，将新冠病毒S蛋和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白；其中，将铁蛋白氨基酸序列前4个氨基酸去掉，然后将连接肽SGG连在铁蛋白N端第5个氨基酸上。所述新冠病毒S蛋白选自ECD(胞外结构域)、S1亚基或RBD(受体结合区)中的任何一种；优选的，本专利技术将NCBI上GenBank序列号：YP_009724390作为相应毒株的抗原基因，以取得最佳的保护效果。所述单体铁蛋白亚基包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单体，其氨基酸序列为NCBI上GenBank序列号：WP_000949190所示；为了促进新冠病毒与铁蛋白融合纳米颗粒的表达效率并提高可溶表达，将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列中第19位天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)以消除糖基化位点。作为本专利技术一种优选的具体实施方式，将新冠病毒S蛋白的ECD(胞外结构域)和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示；将新冠病毒S蛋白的S1亚基和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示；将新冠病毒S蛋白的RBD(受体结合区，为了使RBD和铁蛋白更好融合，RBD区前后各延长三个氨基酸。)和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.7所示；其中，SEQIDNO.1所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示，SEQIDNO.4所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示，SEQIDNO.7所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.8所示。本专利技术为了提高新冠病毒S蛋白ECD、S1、RBD与铁蛋白单体连接后得到的融合蛋白的表达量，本专利技术进一步将SEQIDNO.1，SEQIDNO.4，SEQIDNO.7所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列进行糖基化位点分析，以消除糖基化位点来增加可溶性表达；具体的，本专利技术进一步利用OptimumGeneTM技术对新冠病毒S蛋白和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据大肠杆菌密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变；同时，用人CD5信号肽(GenBankNo.NM_014207.4)来替换S蛋白原有信号肽，加上酶切位点和Kozak序列。由此，本专利技术分别将SEQIDNO.2，SEQIDNO.5，SEQIDNO.8所示的基因序列按照上述原则进行优化后分别得到SEQIDNO.3、SEQIDNO.6、SEQIDNO.9所示的优化后的基因序列。本专利技术将优化后的基因序列在家蚕表达系统中进行表达，根据基因表达产物ELISA效价结果可见，密码子优化后的基因序列的表达量相比优化前有了显著提高。本专利技术在序列优化之后对融合蛋白进行氨基酸单位点突变，双位点突变，以提高其可溶性表达量和表达效率，即，本专利技术以SECD-Ferritin、SS1-Ferritin、SRBD-Ferritin密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对序列进行定点突变，具体的，本专利技术将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列按照F70N,G100L,Q126T,Q145R,T178D,L200S,L240T,T270E,T285D,T326P,T344A,Y362E,Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,,F501A或H530K的中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；将SEQIDNO.4所示的氨基酸序列按照F70N,G100L,Q126T,Q145R,T178D,L200S本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，其特征在于，所述融合蛋白由新冠病毒S蛋白和单体铁蛋白亚基连接得到；优选的，将新冠病毒S蛋和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白。/n
【技术特征摘要】
1.一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，其特征在于，所述融合蛋白由新冠病毒S蛋白和单体铁蛋白亚基连接得到；优选的，将新冠病毒S蛋和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白。
2.按照权利要求1所述的纳米抗原颗粒，其特征在于，所述新冠病毒S蛋白选自S蛋白的胞外结构域、S1亚基或受体结合区中的任何一种；
所述单体铁蛋白亚基选自细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单体，进一步优选的，将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列中第19位天冬酰胺突变为谷氨酰胺。
3.按照权利要求1所述的纳米抗原颗粒，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQIDNO.1、SEQIDNO.4或SEQIDNO.7所示的序列。
4.按照权利要求3所述的纳米抗原颗粒，其特征在于，将SEQIDNO.1，SEQIDNO.4、SEQIDNO.7所示的氨基酸序列分别按照T344A，Y380E，D400S，R419M，R465K或F501A这6种氨基酸单位点突变方式所获得的单位点突变体。
5.按照权利要求3所述的纳米抗原颗粒，其特征在于，将SEQIDNO.1、SEQIDNO.4或SEQIDNO.7所示的氨基酸序列分别按照T334A-Y380E,Y380E-R419M或R419M-R465K的氨基酸双位...
【专利技术属性】
技术研发人员：张志芳，李轶女，刘兴健，宋浩志，易咏竹，高新桃，胡小元，李家磊，李丹，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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