一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立技术

本发明专利技术公开了一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法，主要步骤如下：1)抗体与蛋白标准品准备；2)抗体包被；3)洗板；4)封闭；5)加样；6)加检测抗体；7)加酶标抗体；8)加底物液；9)加终止液；10)测定：用酶标仪测定波长450nm处的OD值。本发明专利技术建立鸡心肌肌钙蛋白I的ELISA检测方法具有灵敏度高、特异性强、定量准确、简单易用等特点，用于肉鸡腹水综合征的早期非损伤性诊断，可作为一种非损伤性方法应用于针对肉鸡腹水综合征的育种方案中，该方法与蛋白质印迹法技术相比操作更为简便，具有更好的基层推广性。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立
本专利技术涉及检测
，尤其涉及一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立。
技术介绍
肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonaryhypertensionsyndrome，PHS)又称肉鸡腹水综合征(AscitesSyndrome，AS)，是一种发生于快速生长的肉鸡的一种，以腹水为主要特征的营养代谢性综合征，其临诊症状还包括：病鸡腹部膨大，皮肤菲薄，可视黏膜发绀；肝脏硬化出现结界；肺脏出血和淤血；右心肥大扩张等。PHS不但造成肉鸡发育不良、屠宰体重不达标，而且引起肉鸡死亡率、淘汰率大幅度上升。肉鸡腹水综合征的死亡率为2％-15％，最高可达10％，每年造成的经济损失达10亿美元。自1896年起，我国报道过该病发生的的已有十多个省份，由于该病的发病率和死亡率高，每年造成我国养鸡业巨大经济损失。研究结果显示,不同品系的鸡群或相同品系内不同的鸡只之间对PHS的易感性不同,表明PHS的发生具有遗传特性。世界上研究肉鸡PHS的大部分学者都认为防治该病的关键应该是从遗传方面着手,对肉鸡进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于，包括下列步骤：/n1)抗体与蛋白标准品准备：兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和心肌肌钙蛋白I标准品由本实验室制备，使用专用的抗体稀释液将两种抗体稀释至固定浓度并分装，并使用1×PBS将心肌肌钙蛋白I标准品稀释至固定浓度并分装，兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体浓度为3mg/mL、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体浓度为2mg/mL、心肌肌钙蛋白I标准品浓度为10ng/mL。/n2)抗体包被：将兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐稀释液稀释混匀后加入到ELIS...

【技术特征摘要】
1.一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于，包括下列步骤：
1)抗体与蛋白标准品准备：兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和心肌肌钙蛋白I标准品由本实验室制备，使用专用的抗体稀释液将两种抗体稀释至固定浓度并分装，并使用1×PBS将心肌肌钙蛋白I标准品稀释至固定浓度并分装，兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体浓度为3mg/mL、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体浓度为2mg/mL、心肌肌钙蛋白I标准品浓度为10ng/mL。
2)抗体包被：将兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释混匀后加入到ELISA酶标板中，每孔100μL，4℃孵育16h；
3)洗板：弃包被液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
4)封闭：加入封闭液，每孔200μL，37℃温育1h；弃封闭液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
5)加样：向孔中加入鸡血清样本，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
6)加检测抗体：将鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
7)加酶标抗体：将山羊抗鼠IgG酶标抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
8)加底物液：每孔加入TMB底物显色液100μL，避光显色30min；
9)加终止液：每孔中加入ELISA终止液50μL；
10)测定，用酶标仪测定波长450nm处的OD值。


2.如权利要求1所述的一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于：所述步骤2)抗体包被中兔源抗鸡cTnI多克隆抗体包被浓度与检测抗体鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体工作浓度的确定采用棋盘滴定法，其中横排加入包被浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，竖排加入检测抗体鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体工作浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，确定兔源抗鸡cTnI多克隆抗体的最佳包被浓度为1.6μg/mL，确定鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体的最佳工作浓度为3.2μg/mL：通过使用3种包被液Tris-Hcl(0.02mol/L)、PBS(0.01mol/L)和CBS(0.05mol/L)进行检测，确定PBS(0....

【专利技术属性】
技术研发人员：潘家强，叶璇，张海燕，韦秀华，马志键，胡莲美，唐兆新，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44