一种基于细胞水平的结合膜蛋白抗体的筛选方法技术

本发明专利技术涉及免疫学检测领域。具体而言，本发明专利技术提供了测定抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法。该方法能够实现在细胞水平对融合瘤上清样品的高通量直接检测，且不受“钩状效应”干扰，具有广阔的临床和研究应用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞水平的结合膜蛋白抗体的筛选方法
本专利技术涉及免疫学检测。具体而言，本专利技术提供了测定抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法。
技术介绍
抗体药物是目前疾病治疗的重要产品，2018年全球药品销售额Top10中，抗体药物有8个，包括单抗药物6个，融合蛋白2个。抗体药物的研发方法目前有融合瘤、噬菌体展示和单B细胞测序三种，其中融合瘤是主流，目前已上市的单抗药物95％以上是通过融合瘤方法研究发现的。而通过融合瘤方法产生的上清抗体库小至数千，大至数万，需要合适的抗体筛选方法找出特异性结合目标抗原的抗体。经典的抗体筛选方法是通过酶联免疫吸附(ELISA)找到蛋白水平结合抗原的抗体，然后再通过流式细胞检测(FCM)进一步验证候选抗体在细胞水平的结合。ELISA中所使用的是抗原的蛋白形式，对于膜蛋白来说，重组表达的蛋白结构和其在细胞膜上的天然结构不可避免的存在差异，这就造成ELISA筛选对于后续FCM筛选的假阳性(ELISA水平结合但FCM水平不结合)/假阴性(FCM水平结合但因ELISA水平不结合没有被筛选出来)。为了避免ELISA筛选的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于测定针对膜蛋白的抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法，其包括以下步骤：/n(1)提供表面固定有表达所述目标膜蛋白的细胞的固相载体；/n(2)将包含待测抗体的待测样品与所述固相载体表面接触；/n(3)将带有可检测标记的二级抗体与所述固相载体表面接触，所述二级抗体能够特异性结合所述待测抗体；/n(4)检测所述固相载体表面的可检测标记；/n优选地，所述可检测标记是荧光标记。/n

【技术特征摘要】
1.用于测定针对膜蛋白的抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法，其包括以下步骤：
(1)提供表面固定有表达所述目标膜蛋白的细胞的固相载体；
(2)将包含待测抗体的待测样品与所述固相载体表面接触；
(3)将带有可检测标记的二级抗体与所述固相载体表面接触，所述二级抗体能够特异性结合所述待测抗体；
(4)检测所述固相载体表面的可检测标记；
优选地，所述可检测标记是荧光标记。


2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)包括以下步骤：测定所述固相载体表面的带有可检测标记的细胞的数量，以及测定所述固相载体表面的细胞总数，从而获得带有可检测标记的细胞在所有细胞中所占的比例；
优选地，所述步骤(4)包括以下步骤：获得所述固相载体表面的荧光图像从而获得所述荧光图像的细胞计数，并且获得所述固相载体表面的明场图像从而获得所述明场图像的细胞计数，从而获得荧光标记的细胞在所有细胞中所占的比例。


3.权利要求2所述的方法，其中，所述方法还包括：(5)将获得的比例与参考值进行比较，或基于所述比例产生剂量-反应曲线(dose-responsecurve)并由此获得待测抗体的EC50，并将该EC50与参考值进行比较，从而确定待测抗体对目标膜蛋白的结合活性；
优选地，所述参考值是对阳性对照样品实施上述步骤(1)-(4)之后所获得的比例或基于该比例获得的EC50；优选地，所述阳性对照样品是已知能够特异性结合所述目标膜蛋白的抗体；优选地，如果所述比例不低于参考值，则判断被检测抗体具有特异性结合所述目标膜蛋白的活性；
优选地，所述待测抗体的EC50通过下述方法获得：利用包含不同量的待测抗体的系列待测样品重复步骤(1)-(4)，从而产生剂量-反应曲线并由此测定该抗体的EC50。


4.权利要求1-3所述的方法，其中，所述固相载体是微量培养板，例如6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、或96孔板；
优选地，所述固相载体是96孔板。


5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，使用细胞成像微孔板检测仪实施步骤(4)。


6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中，步骤(1)包括以下步骤：(1a)提供表达所述目标膜蛋白的细胞；(1b)将所述细胞固定于固相载体表面。


7.权利要求6所述的方法，其中，所述步骤(1b)包括：将细胞接种至固相载体，并使所述细胞沉降至固相载体表面；使用细胞固定剂对沉降至固相载体表面的细胞进行固定；
优选地，所述细胞的接种密度为1.5×104/cm2至5×1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜靓，张红艳，袁纪军，
申请(专利权)人：上海吉倍生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31