粮油作物中多种生物毒素的检测方法技术

本发明专利技术揭示了一种粮油作物中多种生物毒素的检测方法，其特征在于，包括：(1)分别称取不同种类的真菌毒素标样，采用乙腈为溶剂分别对各标样进行溶解并定容获得1mg/mL标准溶液的母液，再稀释成标准溶液，备用；(2)取40g的被测样品原形态样本和60mL纯水放入100mL容积的烧杯中，在将烧杯放入超声波生物毒素提取装置内提取2min，在将烧杯中下层有机相全部转移到离心管中，于40℃以下水浴氮吹至干，加入2m乙腈+水溶液将离心管中残留物溶解并混匀，滤膜过滤即得待测液；(3)制备获得的标准梯度溶液及待测液，液质联用检测，记录数据，(4)计算分别得到待测液中不同种类生物毒素的含量。本发明专利技术测定生物毒素结果准确，为粮食中真菌毒素的检测和污染风险评估提供可靠的保障。

【技术实现步骤摘要】
粮油作物中多种生物毒素的检测方法
本专利技术涉及检测
，具体涉及一种粮油作物中多种生物毒素的检测方法。
技术介绍
粮油原料主要有小麦、玉米、高粮，大米以及糯米，由于含有丰富的营养物质，在田间和储存过程中常受到多种真菌的污染而产生真菌毒素。例如镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)和伏马毒素(Fumonisins，FBs)，黄曲霉产生黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)。欧盟已制定了玉米中DON、ZEN、AFs、FBs、赭曲霉毒素(OTA)、T-2和HT-2等真菌毒素的法规限量和推荐限量，我国食品安全国家标准规定玉米原粮中DON限量为1000μg/kg，ZEN限量为60μg/kg，黄曲霉毒素B1(AFB1)限量为20μg/kg，OTA限量为5μg/kg。真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。其中，酶联免疫法作为快速筛查方法被广泛使用，具有前处理简单、可批量检测样品的优点，但每次只能检测一种真菌毒素，且易受油脂基质干扰，出现假阳性，准确性降低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种粮油作物中多种生物毒素的检测方法，以提高真菌毒素检测的准确性。为实现上述目的，本专利技术提出一种粮油作物中多种生物毒素的检测方法，包括：(1)标准溶液的配制：分别称取不同种类的真菌毒素标样，采用乙腈为溶剂分别对各标样进行溶解并定容获得1mg/mL标准溶液的母液，再根据需要利用乙腈+水溶液将母液稀释成设定浓度的标准溶液，备用；(2)待测液制备：取40g的被测样品原形态样本和60mL纯水同时放入100mL容积的烧杯中，在将烧杯放入超声波生物毒素提取装置内提取2min，在将烧杯中下层有机相全部转移到离心管中，于40℃以下水浴氮吹至干，加入2ml乙腈+水溶液将离心管中残留物全部溶解并混匀，经过0.45μm滤膜过滤即得待测液；(3)分别取制备获得的标准梯度溶液及待测液，液质联用检测，记录数据，(4)计算结果：利用液质联用仪器自带软件，外标法峰面积定量，计算分别得到待测液中不通种类生物毒素的含量。优选地，超声波生物毒素提取装置为21kHz的定频超声波提取装置。优选地，所述步骤(3)中，检测的色谱-质谱条件为：色谱条件：流动相：5mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，流速：0.25ml/min，进样量：20μL，色谱柱：InertsilC8(5μm，2.1ID×150mm)，柱温：30℃，色谱柱平衡时间：2min，梯度洗脱条件如下：0～1min，乙腈相溶剂百分比以10％维持1min，1～3min，线性增加到60％；3～5min，乙腈相溶剂百分比再从60％增加到95％；5～10min，乙腈相溶剂百分比95％维持5min；10～15min，乙腈相溶剂百分比10％维持5min；质谱条件：离子源：ESI源，离子化方式：正离子和负离子切换，扫描模式：多反应监测。优选地，所述步骤(1)中，酒样取用量为5ml，萃取试剂为10ml三氯甲烷，振荡萃取时间为2min，回溶用乙腈水溶液为乙腈+水(3+2)混合溶液，加入量为1ml。优选地，所述步骤(1)中，母液利用乙腈+水溶液稀释成浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00μg/L的标准溶液。优选地，真菌毒素标样选自黄曲霉毒素、脱氧血腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基脱氧血腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧血腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素、杂色曲霉毒素、伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3。优选地，所述样品为小麦、玉米、高粮、大米或糯米。本专利技术的有益效果是：根据本专利技术实施例的粮油作物中多种生物毒素的检测方法，方法简单、便于操作，且采用的仪器价格合理，检测成本低。测定生物毒素结果准确可靠，为粮食和及其产品中真菌毒素的检测和污染风险评估工作提供可靠的技术保障。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例(1)标准溶液的配制：分别称取自伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、脱氧血腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基脱氧血腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧血腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素和杂色曲霉毒素10mg，采用乙腈为溶剂分别对各标样进行溶解并定容以获得标准溶液的母液，且该母液的浓度为1mg/mL，然后根据需要利用乙腈水(3+2)溶液将母液稀释成一定浓度的标准溶液，于-18℃下保存备用。(2)待测液制备：取40g的被测样品原形态样本和60mL纯水同时放入100mL容积的烧杯中，在将烧杯放入超声波生物毒素提取装置内提取2min，在将烧杯中下层有机相全部转移到离心管中，于40℃以下水浴氮吹至干，加入2ml乙腈+水溶液将离心管中残留物全部溶解并混匀，经过0.45μm滤膜过滤即得待测液。(3)液质联用检测：色谱条件流动相：5mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)；流速：0.25ml/min；进样量：20μL；色谱柱：InertsilC8(5μm，2.1ID×150mm)；柱温：30℃；色谱柱平衡时间：2min；梯度洗脱条件如下：0～1min，乙腈相溶剂百分比以10％维持1min，1～3min，线性增加到60％；3～5min，乙腈相溶剂百分比再从60％增加到95％；5～10min，乙腈相溶剂百分比95％维持5min；10～15min，乙腈相溶剂百分比10％维持5min。质谱条件离子源：ESI源；离子化方式：正离子和负离子切换；扫描模式：多反应监测。(4)测定：分别取制备获得的标准梯度溶液，0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00μg/L的标准溶液及待测液，并采用上述色谱质谱条件进行进样检测，记录数据，并得到16种标样的线性回归方程；且经过工作站软件定量计算得到待测液中样品中毒素残留量。对本专利技术方法作如下灵敏度测试：灵敏度测试包括仪器的灵敏度与方法的灵敏度，仪器的灵敏度用仪器的检出限表示，取信噪比≥3的生物毒素混合标准溶液的最小浓度为仪器检出限；方法的灵敏度用方法的定量限表示，取信噪比≥10的生物毒素混合标准溶液的最小浓度为方法定量限。所得的相关数据见表1。对本专利技术方法作如下准确性及重现性实验：选用同一个粮食样品经前处理后作为空白样品，分为3份，分别加入混合标准工作液进行加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种粮油作物中多种生物毒素的检测方法，其特征在于，包括：/n(1)标准溶液的配制：分别称取不同种类的真菌毒素标样，采用乙腈为溶剂分别对各标样进行溶解并定容获得1mg/mL标准溶液的母液，再根据需要利用乙腈+水溶液将母液稀释成设定浓度的标准溶液，备用；/n(2)待测液制备：取40g的被测样品原形态样本和60mL纯水同时放入100mL容积的烧杯中，在将烧杯放入超声波生物毒素提取装置内提取2min，在将烧杯中下层有机相全部转移到离心管中，于40℃以下水浴氮吹至干，加入2m乙腈+水溶液将离心管中残留物全部溶解并混匀，经过0.45μm滤膜过滤即得待测液；/n(3)分别制备获得的标准梯度溶液及待测液，液质联用检测，记录数据；/n(4)计算结果：利用液质联用仪器自带软件，外标法峰面积定量，计算分别得到待测液中不同种类生物毒素的含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种粮油作物中多种生物毒素的检测方法，其特征在于，包括：
(1)标准溶液的配制：分别称取不同种类的真菌毒素标样，采用乙腈为溶剂分别对各标样进行溶解并定容获得1mg/mL标准溶液的母液，再根据需要利用乙腈+水溶液将母液稀释成设定浓度的标准溶液，备用；
(2)待测液制备：取40g的被测样品原形态样本和60mL纯水同时放入100mL容积的烧杯中，在将烧杯放入超声波生物毒素提取装置内提取2min，在将烧杯中下层有机相全部转移到离心管中，于40℃以下水浴氮吹至干，加入2m乙腈+水溶液将离心管中残留物全部溶解并混匀，经过0.45μm滤膜过滤即得待测液；
(3)分别制备获得的标准梯度溶液及待测液，液质联用检测，记录数据；
(4)计算结果：利用液质联用仪器自带软件，外标法峰面积定量，计算分别得到待测液中不同种类生物毒素的含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，超声波生物毒素提取装置为21kHz的定频超声波提取装置。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，检测的色谱-质谱条件为：
色谱条件：流动相：5mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，流速：0.25ml/min，进样量：20μL，色谱柱：InertsilC8(5μm，2.1ID×150mm)，柱温：30℃，色谱柱平衡时间：2min，
梯度洗脱条件如下：0～1min，乙腈相溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏春雁，刘笑笑，宋志峰，樊慧梅，马虹，孟繁磊，仇建飞，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22