一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法技术

本发明专利技术涉及一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，其包括S1、预冻，预冻条件为：冷阱温度≤‑80℃，气压为一个大气压，用时30～40min升温至‑55℃～‑45℃，并维持230～260min；S2、升华干燥，S2.1、一阶升华，一阶升华条件为：冷阱温度≤‑80℃，真空度8‑10pa，用时55～70min升温至‑35～‑30℃，并维持300～330min；S2.2、二阶升华，二阶升华条件为：冷阱温度≤‑80℃，真空度8‑10pa，用时30～40min升温至‑25～‑20℃，并维持1500～1600min；S3、解析干燥，解析干燥条件为：冷阱温度≤‑80℃，真空度0pa，用时60～90min升温至26～30℃，并维持400～600min，制得CRM197蛋白冻干粉。本发明专利技术具有CRM197蛋白冻干粉的各项质量与冻干前皆无明显差异，同时具有较高的稳定性的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法
本专利技术涉及疫苗冻干的
，尤其是涉及一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法。
技术介绍
CRM197是白喉毒素的无毒变异体，与天然白喉毒素相比，CRM197蛋白在结构上仅是A片段上第52位的甘氨酸残基被谷氨酸残基取代，从而使得其酶催化活性丧失，因而不能对细胞产生毒性作用；但由于其B片段的蛋白序列及结构未发生任何变化，没有毒性的CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合。即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，且其与其它多种白喉毒素及变异体相比，具有完全无毒，完整性最高、突变最少、结构最接近，受体阻断能力最强的优点。因此CRM197成为一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。但是针对CRM197蛋白的保存，现有技术基本采用液体冻存的方式进行保存，与液体冻存前的CRM197蛋白原液降相比，其质量明显降低且稳定性不高。现有中国专利授权公告号为：CN103627758B的专利文件公开了一种CRM197蛋白的生产方法，包括1)采用白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)进行发酵培养；2)发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理；3)经过澄清之后的发酵液用10kDa超滤膜进行超滤浓缩；4)浓缩液经硫酸铵两次盐析后对沉淀进行复溶；5)复溶液经离子交换捕获CRM197蛋白；6)捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化；7)浓缩至所需浓度保存；步骤7中所述浓缩为步骤6所得的纯化后的蛋白液，采用10kDa或30kDa超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后保存方法为，加入1～5％的抑肽酶和10～20umol/LEDTA后，-20℃冻存或者加入1～5％的抑肽酶和10～20umol/LEDTA后再加入1～5％的蔗糖乳糖或麦芽糖冻干保存。但是上述方法中并没有公开其相关冻干配方及冻干工艺，更未凸显冻干后蛋白的有效期，冻干后的CRM197蛋白冻干粉与冻干前的CRM197蛋白原液相比，其蛋白纯度明显降低。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，具有CRM197蛋白冻干粉的蛋白纯度与冻干前皆无明显差异的特点。本专利技术的上述专利技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，包括以下步骤：S1、预冻将白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30～40min升温至-55℃～-45℃，并维持230～260min；S2、升华干燥S2.1、一阶升华所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8～10pa，用时55～70min升温至-35～-30℃，并维持300～330min；S2.2、二阶升华所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8～10pa，用时30～40min升温至-25～-20℃，并维持1500～1600min；S3、解析干燥所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60～90min升温至26～30℃，并维持400～600min，制得CRM197蛋白冻干粉；所述白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液包括以下原料组分：CRM197蛋白溶液、蔗糖、氢氧化钠、盐酸、注射用水；所述白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液的配制方法为：量取一定量CRM197蛋白溶液，按照测定的蛋白浓度，计算出蛋白总量M；按照9M的重量称量蔗糖，溶解于CRM197蛋白溶液中，使用注射用水稀释至蛋白浓度为2～10mg/mL；使用氢氧化钠或盐酸，调节最终pH为6.5～7.5，即为冻干半成品原液。通过采用上述方案，蔗糖的加入，可增加水分子的表面张力，促使蛋白质分子优先与水分子相互作用，进而使蛋白质分子外表面比蛋白质分子体相中有相对较多的水分子，保护了蛋白质的天然构象。另外，在干燥过程中，蛋白质的水合层被除去，容易导致蛋白质构象被破坏。蔗糖上的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联合位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性。因此，蔗糖在本申请的冻干半成品原液中，不仅能起到低温保护剂的功能，又能起到冻干保护剂的功能。氢氧化钠和盐酸用于调节蛋白质溶液的pH在6.5～7.5的范围内，一方面有利于蛋白质在溶液中的稳定性和溶解性，保护蛋白质的天然结构，防止蛋白质变性；另一方面提升冻干后蛋白质的物理和化学稳定性。注射用水则可调节蛋白浓度，优化蔗糖以及蛋白质之间的最大相容性，一方面可形成结实的蛋白质冻干粉，另一方面便于冷冻干燥以及复水。在实际生产中，由本申请的CRM197蛋白冻干配方，进一步通过本申请的配制方法进行配制冻干前原液，并通过本申请确定的冻干工艺，可使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久；且CRM197蛋白冻干粉的蛋白纯度与冻干前皆无明显差异，稳定性高。综上，本申请的冻干配方简约易操作，成本低廉；冻干工艺流程简洁，经冻干后蛋白质量无明显差异；经真空冷冻干燥将蛋白由液体转变为蛋白粉，易于储存及后期使用；冻干粉经长期稳定性考察，有效期更久。本专利技术进一步配置为：预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30min升温至-45℃，并维持240min。通过采用上述方案，进一步优选预冻条件，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。本专利技术进一步配置为：一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时60min升温至-30℃，并维持300min。通过采用上述方案，进一步优选一阶升华条件，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。本专利技术进一步配置为：二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时30min升温至-25℃，并维持1500min。通过采用上述方案，进一步优选二阶升华条件，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。本专利技术进一步配置为：解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60min升温至26℃，并维持600min。通过采用上述方案，进一步优选解析干燥条件，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。本专利技术进一步配置为：使用注射用水稀释至蛋白浓度为5～8mg/mL。通过采用上述方案，进一步优选蛋白浓度，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、预冻/n将白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液，按照0.5mL/cm

【技术特征摘要】
1.一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、预冻
将白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30～40min升温至-55℃～-45℃，并维持230～260min；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8-10pa，用时55～70min升温至-35～-30℃，并维持300～330min；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8～10pa，用时30～40min升温至-25～-20℃，并维持1500～1600min；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60～90min升温至26～30℃，并维持400～600min，制得CRM197蛋白冻干粉；
所述白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液包括以下原料组分：CRM197蛋白溶液、
蔗糖、氢氧化钠、盐酸、注射用水；
所述白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液的配制方法为：量取一定量CRM197蛋白溶液，按照测定的蛋白浓度，计算出蛋白总量M；按照9M的重量称量蔗糖，溶解于CRM197蛋白溶液中，使用注射用水稀释至蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：马伟，曹方，王丹雅，郭阳漾，
申请(专利权)人：艾美卫信生物药业浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33