重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用制造技术

本发明专利技术公开了重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。本发明专利技术发现重组副溶血弧菌鞭毛蛋白能够诱导相关免疫基因表达并参与相应免疫信号通路的激活，显著提高鱼类的免疫力，有望开发为天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂，进而预防或治疗副溶血弧菌引起的鱼类病害；因此，重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力、制备鱼类免疫增强剂或免疫佐剂中的应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用
本专利技术属于基因工程
更具体地，涉及重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种革兰氏阴性、嗜盐、嗜中温、杆状细菌，常见于热带、温带海洋，在世界各地的沿海生境和河口地区自然分布。经常从各种海产品中分离出来，包括鳕鱼、沙丁鱼、鲭鱼、比目鱼、蛤、章鱼、虾、蟹、龙虾、扇贝和牡蛎等。这种细菌被认为是导致人类胃肠炎、伤口感染和败血症的主要病因。食用生的或未煮熟的海鲜，特别是被副溶血性弧菌污染的贝类，可能导致急性胃肠炎的发展，其特征是腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部绞痛和低热，甚至可导致胃肠炎患者死亡。同时，对有肝病或免疫紊乱等潜在疾病的人也能构成生命威胁。同时，副溶血弧菌是水生动物弧菌病的主要病原菌，可引起与组织损伤有关的炎症。石斑鱼是热带地区的重要的海水养殖经济鱼类，随着养殖规模不断变大，养殖环境逐渐恶化，鱼病干扰日趋严重，给石斑鱼的养殖造成了巨大的经济损失。副溶血弧菌传播速度快，致死率高，危害性大，是广东地区鱼、虾、贝类的主要病原菌。目前，针对副溶血弧菌引起的免疫疾病的主要手段还局限在抗生素水平。许多国家对普通抗生素的细菌耐药性已达到非常高的水平，这可能导致针对普通感染的现有治疗方案失效。因此，迫切需要开发替代生物防治剂。研究表明，两种III型分泌系统(T3SSS1、T3SSS2)是副溶血弧菌的毒力因子；携带TDH和TRH的分离株具有致病性，这两个基因分别编码耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH)，被认为是副溶血性弧菌的主要毒力因子。此外，副溶血弧菌鞭毛蛋白是另外一种已被报道的毒力因子。它是副溶血弧菌鞭毛的主要组成部分，主要参与调控细菌运动并在细菌粘附及入侵宿主细胞的过程中起到主要作用。与多数弧菌种类相同，副溶血弧菌鞭毛蛋白由多种鞭毛蛋白基因编码的蛋白构成。在哺乳动物中，副溶血弧菌鞭毛蛋白作为TLR5和NLRC4的特异性识别配体，二者特异性结合并借助MyD88依赖的信号途径引起相关的炎症反应。在硬骨鱼中，TLR5也能够参与细菌鞭毛蛋白的识别以抵御副溶血弧菌的感染。本专利技术人先前的研究表明，斜带石斑鱼TLR5M(公开日为2019年6月28日、公开号为CN109943651A的中国专利技术专利)和TLR5S(公开日为2018年12月14日、公开号为CN108997491A的中国专利技术专利)均能够参与副溶血弧菌鞭毛蛋白的识别并激活MAPK/NF-kB信号通路，诱导IFNγ2，IL-6，TNFα表达。副溶血弧菌鞭毛蛋白由鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF六个组分组成，然而，副溶血弧菌众多鞭毛蛋白组分中，真正的功能组分还尚未确定。各组分在副溶血弧菌引起的免疫反应中的主要功能，及各组分功能之间的协调关系还需要进一步研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有鱼类抵御副溶血弧菌感染免疫防治方法的缺陷和不足，提供重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。本专利技术的目的是提供重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。本专利技术另一目的是提供重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备鱼类免疫增强剂或免疫佐剂中的应用。本专利技术另一目的是提供重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备预防或治疗鱼类病害的药物中的应用。本专利技术另一目的是提供一种提高鱼类免疫力的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术研究发现，重组副溶血弧菌鞭毛蛋白能够诱导相关免疫基因表达并参与相应免疫信号通路的激活，显著提高鱼类的免疫力，进而预防或治疗由副溶血弧菌引起的病害，有望开发为天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂；因此，以下应用均应在本专利技术的保护范围之内：重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备鱼类免疫增强剂或免疫佐剂中的应用，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备预防或治疗鱼类病害的药物中的应用；所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。优选地，编码副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的ORF片段的核苷酸序列依次如SEQIDNO:1～6所示。优选地，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的氨基酸序列依次如SEQIDNO:7～12所示。优选地，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaC。优选地，所述鱼类病害为副溶血弧菌引起的病害。优选地，所述鱼类为石斑鱼。更优选地，所述石斑鱼为斜带石斑鱼。本专利技术还提供了一种提高鱼类免疫力的方法，利用所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白刺激鱼的免疫细胞；所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。优选地，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaC。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。本专利技术研究发现，重组副溶血弧菌鞭毛蛋白能够诱导相关免疫基因表达并参与相应免疫信号通路的激活，显著提高鱼类的免疫力，进而预防或治疗由副溶血弧菌引起的病害，有望开发为天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂；因此，重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力、制备鱼类免疫增强剂或免疫佐剂、以及预防或治疗鱼类病害的药物中均有良好的应用价值。附图说明图1是副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF基因ORF片段的PCR凝胶电泳图，其中，M代表Marker。图2是pET28a载体图谱。图3是原核表达载体pET28a经XhoI酶切验证凝胶电泳图，其中，M代表Marker，1代表原核表达载体pET28a经XhoI酶切产物。图4是重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF表达形式验证图，其中，M代表Marker，1代表对照组，2代表无IPTG诱导组，3代表经0.5mMIPTG诱导组，4代表超声波破碎后菌体组，5代表超声波破碎后菌液上清组。图5是重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF蛋白纯化最佳洗脱条件验证图，其中，M代表Marker，1代表50mM咪唑浓度的洗脱液，2代表100mM咪唑浓度的洗脱液，3代表200mM咪唑浓度的洗脱液，4代表250mM咪唑浓度的洗脱液，5代表300mM咪唑浓度的洗脱液，6代表350mM咪唑浓度的洗脱液，7代表500mM咪唑浓度的洗脱液。图6是副溶血弧菌FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF重组蛋白验证图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用，其特征在于，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。/n

【技术特征摘要】
1.重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用，其特征在于，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。


2.重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备鱼类免疫增强剂或免疫佐剂中的应用，其特征在于，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。


3.重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备预防或治疗鱼类病害的药物中的应用，其特征在于，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。


4.根据权利要求1～3任一所述的应用，其特征在于，编码副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的ORF片段的核苷酸序列依次如SEQIDNO:1～6所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：卢丹琪，于雪，何良格，张勇，林浩然，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44