修饰型酯酶和其用途制造技术

本发明专利技术的课题在于提供可以期待高反应效率、能够适用于各种用途的修饰型酯酶。本发明专利技术提供一种修饰型酯酶，其具有在序列号1的氨基酸序列中包含选自K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1个或2个以上的氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列，选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰型酯酶和其用途
本专利技术涉及修饰型酯酶。具体而言，提供提高特性的修饰型酯酶和其用途。本申请要求基于2018年5月2日在日本提出的专利申请特愿No.2018-088943号的优先权，参照并援引该专利申请的全部内容。
技术介绍
酯酶是水解酯的酶，许多酯酶从各种生物中被分离出来。具有独特且广泛的底物特异性的来自于乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)的酯酶在工业上的有用性高，例如药品、精细化学品领域等中使用的有机化合物的合成；直至食品中的有害化合物的分解，能够用于涉及多方面的用途(例如参照非专利文献1)。【现有技术文献】【非专利文献】【非专利文献1】应用微生物学与生物技术(ApplMicrobialBiotechnol)(2002)60：288-292
技术实现思路
【专利技术要解决的课题】但是，既然酯酶也是由氨基酸构成的蛋白质，由于使用条件(强酸强碱、高温、高浓度有机溶剂等)致蛋白质变性而不能发挥催化剂功能，因此存在适用范围受限制的情况。例如，对于酶而言，医药中间体的合成反应多在严苛条件下(例如：高温下的反应、有机溶剂中的反应、酸性pH区域的反应)进行，稳定性尤其成问题。因此，根据反应条件，不能得到充分的酶活性，反应效率(收率)降低。于是，本专利技术的课题在于：通过改善来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶的特性，能够在各种使用条件下最大限度地发挥广泛的底物特异性，由此，提高该酯酶的有用性或利用价值。现有的用途中，特性的改善能够带来反应效率等的改善，另一方面能够创造出新用途(即用途的扩大)。解决课题的手段为了解决上述课题，本专利技术人尝试改变来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶。经过反复试验，成功确定对其特性(比活性、高温稳定性、高温反应性、pH稳定性)的改善有效的突变点(氨基酸残基)，得到有用性高的突变体(修饰型酯酶)。在提供用于设计、获得可以达到特性的改善这样的目的的突变体的信息、手段方面，该成果也是重要的。于是，常经历通过组合有效果的2个突变从而产生相加效果或协同效果的可能性高的情况。此外，对于同种酶，结构(一级结构、立体结构)的类似性高，同样的突变产生同样的效果的可能性高，鉴于这样的技术常识，如果将在具有序列号1的氨基酸序列的来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶中发现的有用的突变适用于与该酯酶之间在结构上的类似性高的其他酯酶，则发挥同等的效果的可能性高，此外，本领域技术人员能够认识到这样的适用是有效的。以下的专利技术基于以上的成果和考察。[1]一种修饰型酯酶，其具有在序列号1的氨基酸序列中包含选自K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1种或2种以上的氨基酸取代的氨基酸序列、或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列，与由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶相比较，所述修饰型酯酶的选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。[2]根据[1]所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为S235T，比活性提高。[3]根据[1]所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为K7P、F13Y、L222M或V229I，高温稳定性提高。[4]根据[1]所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为V229I或S235T，高温反应性提高。[5]根据[1]所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T，pH稳定性提高。[6]一种修饰型酯酶，其为序列号2～7中的任一个氨基酸序列或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列(其中，在同源性的基准为序列号2的氨基酸序列的情况时，在第7位脯氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号3的氨基酸序列的情况时，在第13位酪氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号4的氨基酸序列的情况时，在第107位蛋氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号5的氨基酸序列的情况时，在第222位蛋氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号6的氨基酸序列的情况时，在第229位异亮氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号7的氨基酸序列的情况时，在第235位苏氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同)，与由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶相比较，所述修饰型酯酶的选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。[7]一种基因，其编码[1]～[6]中任一项所述的修饰型酯酶。[8]根据[7]所述的基因，其中，所述基因包含序列号8～13中任一个碱基序列。[9]一种重组DNA，其包含[7]或[8]所述的基因。[10]一种微生物，其保有[9]所述的重组DNA。[11]根据[10]所述的微生物，其宿主为：大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacilluschosinensis)。[12]一种酶制剂，其包含[1]～[6]中任一项所述的修饰型酯酶。[13]一种修饰型酯酶的制备方法，其包括以下的步骤(I)～(III)：(I)准备编码序列号2～7中的任一个氨基酸序列的核酸的步骤；(II)使上述核酸表达的步骤，和(III)回收表达产物的步骤。附图说明【图1】突变体的比活性。将突变体的比活性与野生型酶相比较。【图2】突变体的高温下的稳定性。将在80℃下处理30分钟后的活性残存率与野生型酶相比较。【图3】突变体的高温下的反应性。将相对活性(60℃下的酶活性相对于30℃下的酶活性之比率)与野生型酶相比较。【图4】突变体的pH稳定性。将pH4.0条件下处理30分钟后的活性残存率与野生型酶相比较。具体实施方式为了便于说明，对于一部分与本专利技术相关而使用的术语作以下定义。(术语)术语“修饰型酯酶”是指将作为基准的酯酶(以下称为“基准酯酶”)修饰或突变而得到的酶。典型而言，基准酯酶是具有序列号1的氨基酸序列的来自于乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)的酯酶。术语“来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶”是指其起源于乙酸钙不动杆菌的酯酶，包括乙酸钙不动杆菌产生的酯酶或使用该酯酶的遗传信息而由其他微生物等表达的酯酶等。本专利技术中，作为修饰或突变，进行“氨基酸的取代”。因此，如果比较修饰型酯酶和基准酯酶，则发现部分氨基酸残基存在不同。此外，在本说明书中，将修饰型酯酶也称为修饰型酶或突变体。本说明书中根据惯例，如以下所示，用1个字母表述各氨基酸。蛋氨酸：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰型酯酶，具有在序列号1的氨基酸序列中包含选自K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1种或2种以上的氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列，与由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶相比较，所述修饰型酯酶的选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180502 JP 2018-0889431.一种修饰型酯酶，具有在序列号1的氨基酸序列中包含选自K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1种或2种以上的氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列，与由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶相比较，所述修饰型酯酶的选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。


2.根据权利要求1所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为S235T，比活性提高。


3.根据权利要求1所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为K7P、F13Y、L222M或V229I，高温稳定性提高。


4.根据权利要求1所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为V229I或S235T，高温反应性提高。


5.根据权利要求1所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T，pH稳定性提高。


6.一种修饰型酯酶，其为序列号2～7中的任一个氨基酸序列或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列，
其中，在同源性的基准为序列号2的氨基酸序列的情况时，在第7位脯氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号3的氨基酸序列的情况时，在第13位酪氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉田和典，高桥哲也，石川一彦，
申请(专利权)人：天野酶制品株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP