利用人工构建RNA编辑酶进行RNA定点编辑及相关应用制造技术

提供了利用人工构建RNA编辑酶进行RNA定点编辑及相关应用。提供了将用于结合RNA的RNA识别结构域(RNA recognition domain)和发挥功能的效用结构域(effector domain)融合，组成新的功能蛋白，其通过识别结构域特异性靶向目标RNA并利用效用结构域来进行RNA编辑。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用人工构建RNA编辑酶进行RNA定点编辑及相关应用
本专利技术属于生物领域，具体地，本专利技术涉及利用人工构建RNA编辑酶进行RNA定点编辑及相关应用。
技术介绍
DNA是生物体内最主要的遗传物质。目前，已知的人类疾病中很大一部分是由遗传突变导致的，单碱基突变是其中最大的一类。因此，开发一种方法来改变基因组中单个碱基的序列，高效、精准地修复致病单碱基突变对研究和治疗遗传病非常有意义。目前的针对单碱基突变疾病的基因治疗策略，主要是通过在DNA或RNA水平直接修复或替代突变基因、而从治疗疾病的策略。主要方法有基于CRISPR技术的针对DNA的碱基编辑系统ABE和CBE，这些技术都能在一定程度上进行碱基编辑，但是也还存在很多不足：(1)目前的CRISPR介导的碱基编辑系统精确度不足，进行单碱基编辑效率较低，普遍存在一个编辑窗口，在对靶位点进行编辑的时候，会引入额外的突变。(2)CRISPR系统非常庞大，目前的基因导入技术很难一次性将整个CRISPR系统包裹在同一个体系里，进行递送，所以在治疗过程中存在低效的基因导入，编辑效率低。(3)受转基因大小的限制，有些基因组位点很难转入。(4)作为细菌蛋白的Cas蛋白引起的免疫应答和毒性。(5)基因插入时产生的突变或整合时发生的一些意料外的事件。尤其重要的是，由于基因组DNA的改变会伴随细胞一生，因而基因组DNA编辑的长期安全性担忧一直是个较大的问题。因此，本领域技术人员急需开发一种能够有效地对基因进行编辑的方法，以便对单碱基突变疾病进行有效的基因治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够有效地对基因进行编辑的方法及其应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种RNA编辑酶，所述RNA编辑酶包括：(a)RNA识别结构域，所述RNA识别结构域用于识别待编辑的RNA序列的RNA识别序列，并结合于所述的RNA识别序列；(b)效用结构域，所述的效用结构域用于对待编辑的RNA序列进行核苷酸编辑；其中，所述的RNA识别结构域与所述的效用结合域是可操作地连接的。在另一优选例中，所述效用结构域选自下组：ADAR家族成员的脱氨基催化结构域、APOBEC家族成员的脱氨基催化结构域、RNA甲基化酶、RNA去甲基化酶、加尿嘧啶合成酶、或其组合。在另一优选例中，所述的RNA识别结构域含有n个识别单元，所述的每个识别单元用于识别一个RNA碱基，其中n为5-30的正整数。在另一优选例中，n为6-24，更佳地为8-20，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24。在另一优选例中，每个识别单元为α-螺旋的重复序列，并且所述重复序列上特定位置的三个氨基酸来负责结合RNA碱基。在另一优选例中，所述的n个识别单元是串联的，构成RNA碱基识别区。在另一优选例中，所述的RNA识别结构域还包括任选的分别位于RNA碱基识别区两侧的保护区，用于保护所述的RNA碱基识别区。在另一优选例中，所述的RNA识别结构域来自PUF蛋白。在另一优选例中，所述的RNA识别结构域不包括PUF蛋白中位于RNA碱基识别区上游的结构域(保护区除外)，但可包括或不包括PUF蛋白中位于RNA碱基识别区下游的结构域(保护区除外)。在另一优选例中，所述的保护区是在RNA碱基识别区的两端的没有功能的重复序列。在另一优选例中，所述的RNA编辑酶还包括选自下组的一种或多种元件：连接肽、标签序列、信号肽序列、定位肽序列、或其组合。在另一优选例中，所述的定位肽序列包括细胞核定位信号序列、线粒体定位信号序列、或其组合。在另一优选例中，所述的一种或多种元件与所述的RNA识别结构域和效用结构域是可操作地连接的。在另一优选例中，所述的一种或多种元件各自独立地位于所述的RNA编辑酶的N端和/或C端和/或中间。在另一优选例中，所述的信号肽位于所述的RNA编辑酶的N端。在另一优选例中，所述的连接肽、标签序列、和/或定位肽信号各自独立地位于所述识别结构域和效用结构域之间。在另一优选例中，所述的RNA为单链。在另一优选例中，所述RNA编辑酶包括RNA识别结构域和效用结构域，以及任选的连接肽、标签序列、信号肽序列和/或定位肽序列。在另一优选例中，所述RNA编辑酶的结构如下式I至式IV中任一所示：D-L2-A-L1-B(I)；D-L2-B-L1-A(II)；A-L1-B-L2-D(III)；B-L1-A-L2-D(IV)；式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；A为RNA识别结构域；B为效用结构域；L1和L2各自独立地为无或连接肽；D为无或定位肽。在另一优选例中，所述的定位肽位于所述RNA编辑酶的N、C端或中间。在另一优选例中，所述RNA识别结构域为可识别并结合RNA的结构域，较佳地来源于RNA结合蛋白。在另一优选例中，所述RNA识别结构域为PUF蛋白片段。在另一优选例中，所述PUF蛋白片段为PUF蛋白中可识别结合RNA的结构域的片段。在另一优选例中，所述PUF蛋白包括PUF蛋白及其同源蛋白。在另一优选例中，所述PUF蛋白来自哺乳动物，较佳地来自灵长动物，更佳地来自人。在另一优选例中，所述RNA识别结构域具有如SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述ADAR家族成员包括：dADAR、ADAR1、ADAR2、TadA、或其组合。在另一优选例中，所述ADAR家族成员来源于人或果蝇或细菌。在另一优选例中，所述ADAR家族成员包括：果蝇ADAR、人ADAR1、人ADAR2、大肠杆菌TadA、或其组合。在另一优选例中，所述ADAR1包括天然的ADAR1和ADAR1突变体。在另一优选例中，所述ADAR1突变体在对应于天然的ADAR1的氨基酸序列中第1008位发生突变；优选地，所述第1008位谷氨酸(E)突变为谷氨酰胺(Q)。在另一优选例中，所述效应结构域来自ADAR1，具有SEQIDNO.:2所示的氨基酸序列：或者所述效应结构域是ADAR1-E1008Q效应结构域，其氨基酸序列与SEQIDNo.:2相同，但SEQIDNo.:2中第211位从E突变为Q：KAERMGFTEVTPVTGASLRRTMLLLSRSPEAQPKTLPLTGSTFHDQIAMLSHRCFNTLTNSFQPSLLGRKILAAIIMKKDSEDMGVVVSLGTGNRCVKGDSLSLKGETVNDCHAEIISRRGFIRFLYSELMKYNSQTAKDSIFEPAKGGEKLQIKKTVSFHLYISTAPCGDGALFDKSCSDRAMESTESRHYPVFENPKQGKLRTKVENGQGTIPVESSDIVPTWDGIRLGE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNA编辑酶，其特征在于，所述RNA编辑酶包括：/n(a)RNA识别结构域，所述RNA识别结构域用于识别待编辑的RNA序列的RNA识别序列，并结合于所述的RNA识别序列；/n(b)效用结构域，所述的效用结构域用于对待编辑的RNA序列进行核苷酸编辑；/n其中，所述的RNA识别结构域与所述的效用结合域是可操作地连接的。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190408 CN 2019102774230一种RNA编辑酶，其特征在于，所述RNA编辑酶包括：
(a)RNA识别结构域，所述RNA识别结构域用于识别待编辑的RNA序列的RNA识别序列，并结合于所述的RNA识别序列；
(b)效用结构域，所述的效用结构域用于对待编辑的RNA序列进行核苷酸编辑；
其中，所述的RNA识别结构域与所述的效用结合域是可操作地连接的。


如权利要求1所述的RNA编辑酶，其特征在于，所述效用结构域选自下组：ADAR家族成员的脱氨基催化结构域、APOBEC家族成员的脱氨基催化结构域、RNA甲基化酶、RNA去甲基化酶、加尿嘧啶合成酶、或其组合。


如权利要求1所述的RNA编辑酶，其特征在于，所述的RNA识别结构域含有n个识别单元，所述的每个识别单元用于识别一个RNA碱基，其中n为5-30的正整数。


如权利要求1所述的RNA编辑酶，其特征在于，所述的RNA编辑酶还包括选自下组的一种或多种元件：连接肽、标签序列、信号肽序列、定位肽序列、或其组合。


如权利要求1所述的RNA编辑酶，其特征在于，所述RNA编辑酶包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽峰，韩文建，
申请(专利权)人：中国科学院上海营养与健康研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31