柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记及其应用和检测方法技术

本发明专利技术公开了柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记及其在柑橘全爪螨对双甲脒敏感品系和抗性品系的分类中的应用，所述分子标记为柑橘全爪螨β‑2R章鱼胺受体基因SNP突变T752C；还公开了所述分子标记的检测方法：先提取待测柑橘全爪螨的总DNA，以总DNA为模板用特异性正反向引物进行PCR扩增，得到包含突变区域的β‑2R章鱼胺受体基因片段，将得到的基因片段与该分子标记进行序列比对，即可判断该品系是对双甲脒的敏感品系还是抗性品系。所述特异性正反向引物序列为：F：5’‑AACCTTCAGAATCAGTGTAATCATC‑3’；R：5’‑CTTCCATAGATTGTTGTTGTTGTTG‑3’。

【技术实现步骤摘要】
柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记及其应用和检测方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种分子标记，尤其涉及一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记及其应用和检测方法。
技术介绍
柑橘全爪螨(Panonychuscitri)为世界性柑橘害螨，在中国季节性爆发的现象越来越频繁，主要原因在于果园害螨种群动态监控不得当，缺乏预警机制，加之杀螨剂使用不规范所造成的害螨抗药性问题，使得化学防控效果减弱。柑橘全爪螨已对联苯肼酯、螺螨酯、阿维菌素、噻螨酮等多种化学杀螨剂产生不同程度抗性。由于新型、高效杀螨剂市场更新迭代过慢，目前已经难以满足生产者对害螨有效防控的要求。双甲脒为一种广谱性杀虫/螨剂，常用于家畜、宠物表皮寄生虫防治，此外，该药剂对蚜虫、木虱、蜱虫，害螨也表现出良好的致死效果，近年来常用于防控柑橘全爪螨，以缓解其他类型杀螨剂由于抗药性造成的防效下降问题。根据杀虫剂抗性执行委员会(InsecticideResistanceActionCommittee,IRAC)分类，双甲脒属于章鱼胺受体激动剂，主要作用于章鱼胺受体，刺激害虫不断产生兴奋而死。目前对该药剂抗性机理研究主要集中在寄生蜱虫β-adrenergic章鱼胺受体和OCT/Tyr受体基因突变，单胺氧化酶(MO)及ABC转运蛋白活性的改变等。而叶螨科害螨对双甲脒的抗性分子机制，还未有学者报道。
技术实现思路
针对上述领域的需求和存在的问题，本专利技术在敏感品系的基础上，通过室内长期药剂筛选，获得柑橘全爪螨双甲脒抗性品系，并通过基因组重测序技术以及田间抗性种群突变频率分析，探究柑橘全爪螨对双甲脒的抗药性分子机制，为柑橘全爪螨抗药性治理提供理论依据，以期更好地监控和延缓害螨对双甲脒抗药性。具体技术方案概括如下：一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记，所述分子标记为柑橘全爪螨β-2R章鱼胺受体基因SNP突变T752C。所述的分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNo:5所示。上述的分子标记在柑橘全爪螨对双甲脒敏感品系和抗性品系的分类中的应用。检测上述的分子标记的特异性正反向引物，所述引物序列如下：F：5’-AACCTTCAGAATCAGTGTAATCATC-3’；R：5’-CTTCCATAGATTGTTGTTGTTGTTG-3’。一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记的检测方法：先提取待测柑橘全爪螨的总DNA，以总DNA为模板用权利要求4中的特异性正反向引物进行PCR扩增，得到包含突变区域的β-2R章鱼胺受体基因片段，将得到的基因片段与权利要求1中的柑橘全爪螨对双甲脒的分子标记进行序列比对，即可判断该品系是对双甲脒的敏感品系还是抗性品系。所述PCR扩增的反应体系为：2×PhantaMaxMasterMix25μL，浓度10μM的正反向引物各2μL，待测样本DNA模板2μL，补充ddH2O至50μL。所述PCR的扩增程序为：95℃预变性3min；然后95℃变性15sec，54℃退火15sec，72℃延伸10sec，40个循环；最后72℃延伸5min。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术通过基因组重测序技术—BSA性状定位(BulkedSegregantAnalysis)发掘了柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记，并在田间种群中得到了验证。该标记的特异性强、稳定性高，通过对柑橘全爪螨待测样本的该分子标记的突变频率分析，即可得知待测样本是对双甲脒的敏感品系还是抗性品系，可随时监测田间柑橘全爪螨的抗药性水平，做好害螨抗药性治理工作，对于减少化学农药的使用、环境保护、果园可持续发展有重要意义。2)本专利技术提供了柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记的特异性正反向引物，还提供了优化的PCR体系和扩增程序，可以成功快速地从柑橘全爪螨中扩增出一条220bp的DNA条带，该条带即是与柑橘全爪螨对双甲脒抗性密切相关的序列，该方法操作简便快捷，检测特异性强、灵敏度高。附图说明图1是柑橘全爪螨混池基因组DNA琼脂糖电泳图，其中，M:λ-HindIIIdigest,1,2,3,4分别为P(SS)、P(RR)、F(SS)、F(RR)。图2是候选区间内与性状相关的SNPs分布、突变类型及基因注释。图3是ΔSNP-index和ED值评估候选SNPs与性状的关联度结果。图4是柑橘全爪螨抗、敏品系中β-2R章鱼胺受体基因突变位点(T752C)所处位置，图中，SS为敏感品系，RR为抗性品系。图5是柑橘全爪螨β-2R章鱼胺受体第752位三种基因型Sanger测序结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但并不因此而限制本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。1.材料1.1供试螨源供试螨源敏感品系(SS)：实验室柑橘全爪螨原始种群为2005年采自柑桔研究所(重庆·北碚)果园边多年未施药的枳壳上，在实验室内不接触农药，用枳橙连续继代饲养至今，视为杀螨剂-敏感品系。抗性品系(RR)：挑取3000头敏感品系柑橘全爪螨雌成螨，放置于30张平整的柠檬叶片上，每张叶片100头螨。将叶片放置于含有海绵-水的玻璃皿中，叶片周边用湿棉线包围，防止螨逃逸。将饲养装置放置于波特喷雾塔下，对螨喷洒稀释1000倍的双甲脒乳油，喷洒体积为1mL，然后将饲养装置放置于温度为25±1℃，相对湿度为70％-80％，光周期14L∶10D的光照培养箱中。药剂处理24小时后，将存活的螨接种到无虫枳壳植株上进行扩大、隔离饲养。待螨种群扩大后，适时喷洒双甲脒乳油进行压力筛选，逐步建立抗性种群(RR)。经过多代筛选，柑橘全爪螨对双甲脒的LC50由29.03mg/L提高到了2361.45mg/L，其抗性品系较敏感品系增长了81.35倍。此后每隔一段时间视其种群密度对其进行药剂处理，保证其抗性不会出现衰退。1.2主要试剂来源无毒核酸染液Gel-Red(苏州恒宇生物科技有限公司，货号：S2001)，TAE电泳缓冲液速溶颗粒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：G102)，2×PhantaMaxMasterMix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：P515)，20％双甲脒乳油(爱利思达生物化学品(上海)有限公司)，MolluscDNAKit(OmegaBio-Tek公司，货号：D3373)，TissueEx-AmpPCRKit(AppliedBiologicalMaterialsInc，货号G927)。2.方法2.1柑橘全爪螨抗敏品系杂交及性状分离挑取约200头敏感柑橘全爪螨(SS)到柠檬叶片上饲养，叶片置于含有海绵的培养皿中，用湿棉线包围叶片防止螨逃逸，饲养装置置于25℃光照培养箱(L14：D10)中饲养3天，获得足够数量的卵。待卵孵化后，将雄性螨从饲养装置清除，只剩雌性螨，继续培养至交配前期(静伏期)备用。挑取约200头双甲脒抗性柑橘全爪螨(RR)，按照上述方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记，其特征在于：所述分子标记为柑橘全爪螨β-2R章鱼胺受体基因SNP突变T752C。/n

【技术特征摘要】
1.一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记，其特征在于：所述分子标记为柑橘全爪螨β-2R章鱼胺受体基因SNP突变T752C。


2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo:5所示。


3.如权利要1或2所述的分子标记在柑橘全爪螨对双甲脒敏感品系和抗性品系的分类中的应用。


4.检测权利要求1或2所述的分子标记的特异性正反向引物，其特征在于：所述引物序列如下：
F：5’-AACCTTCAGAATCAGTGTAATCATC-3’；
R：5’-CTTCCATAGATTGTTGTTGTTGTTG-3’。


5.一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记的检测方法，其特征在于：先提取待测柑橘全...

【专利技术属性】
技术研发人员：于士将，丛林，冉春，刘浩强，李鸿筠，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50