用于检测犀牛源性成分的引物探针组及其应用制造技术

本发明专利技术公开用于检测犀牛源性成分的引物探针组及其应用。本发明专利技术首先公开了用于检测犀牛源性成分的引物探针组，包括用于检测白犀牛源性成分的引物探针Ⅰ、用于检测黑犀牛源性成分的引物探针Ⅱ、用于检测印度犀牛源性成分的引物探针III、用于检测苏门答腊犀牛源性成分的引物探针IV和/或用于检测爪哇犀牛源性成分的引物探针V，序列如SEQ ID NO.1‑12所示。本发明专利技术还公开基于所述引物探针组建立的检测犀牛源性成分的方法。本发明专利技术以犀牛细胞色素b部分基因作为靶区域设计引物和TaqMan探针建立并优化得到可检测现存5种犀牛源性成分的方法，该方法快速、灵敏和特异，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
用于检测犀牛源性成分的引物探针组及其应用
本专利技术涉及动物源性成分检测领域。更具体地，涉及一种用于检测犀牛源性成分的引物探针组及其应用。
技术介绍
犀牛(rhinoceros)是犀牛科(Rhinocerotidae)的一种标志性大型草食性动物。目前现存的五种犀牛，其中，白犀牛(Whiterhino,拉丁文：Ceratotheriumsimum)和黑犀牛(Blackrhino，拉丁文：Dicerosbicornis)原产于非洲，印度犀牛(Indianrhino，拉丁文：Rhinocerosunicornis)、苏门答腊犀牛(Sumatranrhino，拉丁文：Dicerorhinussumatrensis)和爪哇犀牛(Javanrhino，拉丁文：Rhinocerossondaicus)均为原产于亚洲。到1977年，所有五种犀牛都被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)的保护名录中。CITES签约国通过立法禁止国家之间的犀牛或犀牛产品的商业贸易，以确保商业贸易不会进一步威胁犀牛的生存。在某些国家，犀牛角不仅被作为传统药物使用，而且一些人们将购买和消费犀牛角作为身份地位的象征。特别是近十多年来，由于犀牛角需求的急剧增长推动了针对犀牛的偷猎行为。研制和开发灵敏特异的犀牛源性成分检测方法，对于打击当前犀牛偷猎行为，含犀牛源成分产品的走私行为具有强有力的作用，而且有效的测试方法可以为相关执法行动提供证据。为追求产品利润，市场上还存在大量假冒犀牛角产品。为了确定商家是否存在贩卖受保护动物产品的行为，对相关产品进行的物种鉴定试验是调查取证的重要一环。此外，在实际工作中，往往还需要进一步查明所缉获的犀牛角的种属，这不仅是为了提供法律依据，而且也有利于查清犀牛角贩运活动的产地、链条和市场趋势。基于以上原因，开发快速敏感鉴别现存5种犀牛源性成分的方法具有重要意义。经过加工的犀牛角产品往往难以从形态上进行区分，特别是对于加工成粉末、小碎片或工艺品之后产品更是难以鉴别。目前已用的犀牛角鉴定方法包括同位素指纹技术、红外光谱方法以及基于挥发性有机物的气味分析方法等，但均不能特异的鉴定到种。基于核酸的动物物种鉴定通常是以线粒体基因为靶标，最常见的是细胞色素b(Cyt-b)基因和细胞色素c氧化酶I(CO1)基因。目前已有针对犀牛Cyt-b建立的PCR和套式PCR方法，但这两个方法均需要进一步测序来对结果进行判定。TaqMan荧光定量PCR检测技术与常规PCR技术相比，具有很多突出的优点，不仅检测速度快(仅需2h)，结果可靠，而且不需要开盖分析产物，从而减少气溶胶污染的机会。因此，基于TaqMan荧光定量PCR检测技术对现存5种犀牛的进行精准区分，具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供用于检测犀牛源性成分的引物探针组、试剂盒及其应用。本专利技术的另一个目的是提供检测犀牛源性成分的方法，该方法灵敏、特异，能够实现对现存5种犀牛的快速检测。为达到上述目的，第一方面，本专利技术提供了用于检测犀牛源性成分的引物探针组，所述犀牛为白犀牛(Ceratotheriumsimum)、黑犀牛(Dicerosbicornis)、印度犀牛(Rhinocerosunicornis)、苏门答腊犀牛(Dicerorhinussumatrensis)和/或爪哇犀牛(Rhinocerossondaicus)，所述引物探针组包括用于检测白犀牛源性成分的引物探针Ⅰ、用于检测黑犀牛源性成分的引物探针Ⅱ、用于检测印度犀牛源性成分的引物探针III、用于检测苏门答腊犀牛源性成分的引物探针IV和/或用于检测爪哇犀牛源性成分的引物探针V；所述引物探针Ⅰ、引物探针Ⅱ、引物探针III、引物探针IV和引物探针V中均包括SEQIDNO.1所示的单链DNA分子和SEQIDNO.2所示的单链DNA分子组成的引物对；所述引物探针Ⅰ还包括SEQIDNo.3所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.4所示的TaqMan探针；所述引物探针Ⅱ还包括SEQIDNo.5所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.6所示的TaqMan探针；所述引物探针III还包括SEQIDNo.7所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.8所示的TaqMan探针；所述引物探针IV还包括SEQIDNo.9所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.10所示的TaqMan探针；所述引物探针V还包括SEQIDNo.11所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.12所示的TaqMan探针；其中，r代表g或a，y代表t或c。进一步，所述TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述SEQIDNo.3所示的TaqMan探针、SEQIDNo.5所示的TaqMan探针、SEQIDNo.7所示的TaqMan探针、SEQIDNo.9所示的TaqMan探针和SEQIDNo.11所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光报告基团为CY5和3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ2；所述SEQIDNo.4所示的TaqMan探针、SEQIDNo.6所示的TaqMan探针和SEQIDNo.10所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM和3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1，所述SEQIDNo.8所示的TaqMan探针和SEQIDNo.12所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM和3’端标记的荧光淬灭基团为MGBNFQ。本专利技术上述引物探针组中引物探针Ⅰ、引物探针Ⅱ、引物探针III、引物探针IV和引物探针V可以组合进行保护，也可以包含其中任两组、三组和四组组合或单独一组进行保护。第二方面，本专利技术提供了上述用于检测犀牛源性成分的引物探针组在如下任一中的应用：A、检测犀牛源性成分中的应用；B、在制备检测犀牛源性成分的试剂或试剂盒中的应用。第三方面，本专利技术提供了一种用于检测犀牛源性成分的试剂或试剂盒，其有效成分为上述用于检测犀牛源性成分的引物探针组。进一步，所述试剂或试剂盒还包括荧光定量PCR反应的其他试剂，例如荧光定量PCR反应液、阴性对照、阳性对照、水等中的至少一种，所述荧光定量PCR反应液可包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和TaqDNA聚合酶等。进一步，所述阴性对照可为牛组织样品，例如用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲盐水制成质量百分比为20％的牛组织悬液。进一步，所述阳性对照可为含有目的扩增基因的质粒DNA；例如用于检测白犀牛源性成分的阳性对照为PEsz-T-WR-Cytb540，即将SEQIDNO.13所示的长度为540bp的白犀牛细胞色素b(CytbB)部分基因克隆于PEsz-T载体的TA克隆位点获得的；用于检测黑犀牛源性成分的阳性对照为pBSK-BR-Cytb299，即将SEQIDNO.14所示的长度为299bp的黑犀牛细胞色素b(CytbB)部分基因克隆于pBluescriptIISK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测犀牛源性成分的引物探针组，其特征在于，所述犀牛为白犀牛、黑犀牛、印度犀牛、苏门答腊犀牛和/或爪哇犀牛，所述引物探针组包括用于检测白犀牛源性成分的引物探针Ⅰ、用于检测黑犀牛源性成分的引物探针Ⅱ、用于检测印度犀牛源性成分的引物探针III、用于检测苏门答腊犀牛源性成分的引物探针IV和/或用于检测爪哇犀牛源性成分的引物探针V；/n所述引物探针Ⅰ、引物探针Ⅱ、引物探针III、引物探针IV和引物探针V中均包括SEQ IDNO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成的引物对；/n所述引物探针Ⅰ还包括SEQ ID No.3所示的TaqMan探针和/或SEQ ID No.4所示的TaqMan探针；/n所述引物探针Ⅱ还包括SEQ ID No.5所示的TaqMan探针和/或SEQ ID No.6所示的TaqMan探针；/n所述引物探针III还包括SEQ ID No.7所示的TaqMan探针和/或SEQ ID No.8所示的TaqMan探针；/n所述引物探针IV还包括SEQ ID No.9所示的TaqMan探针和/或SEQ ID No.10所示的TaqMan探针；/n所述引物探针V还包括SEQ ID No.11所示的TaqMan探针和/或SEQ ID No.12所示的TaqMan探针。/n...

【技术特征摘要】
1.用于检测犀牛源性成分的引物探针组，其特征在于，所述犀牛为白犀牛、黑犀牛、印度犀牛、苏门答腊犀牛和/或爪哇犀牛，所述引物探针组包括用于检测白犀牛源性成分的引物探针Ⅰ、用于检测黑犀牛源性成分的引物探针Ⅱ、用于检测印度犀牛源性成分的引物探针III、用于检测苏门答腊犀牛源性成分的引物探针IV和/或用于检测爪哇犀牛源性成分的引物探针V；
所述引物探针Ⅰ、引物探针Ⅱ、引物探针III、引物探针IV和引物探针V中均包括SEQIDNO.1所示的单链DNA分子和SEQIDNO.2所示的单链DNA分子组成的引物对；
所述引物探针Ⅰ还包括SEQIDNo.3所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.4所示的TaqMan探针；
所述引物探针Ⅱ还包括SEQIDNo.5所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.6所示的TaqMan探针；
所述引物探针III还包括SEQIDNo.7所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.8所示的TaqMan探针；
所述引物探针IV还包括SEQIDNo.9所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.10所示的TaqMan探针；
所述引物探针V还包括SEQIDNo.11所示的TaqMan探针和/或SEQIDNo.12所示的TaqMan探针。


2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。


3.根据权利要求1或2所述的引物探针组，其特征在于，所述SEQIDNo.3所示的TaqMan探针、SEQIDNo.5所示的TaqMan探针、SEQIDNo.7所示的TaqMan探针、SEQIDNo.9所示的TaqMan探针和SEQIDNo.11所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光报告基团为...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪琳，高志强，蒲静，尹羿，赵相鹏，任彤，张伟，赖平安，肖春芳，时培蛟，
申请(专利权)人：中国海关科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11