检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开了检测地中海贫血基因的引物对和探针，包括β‑地中海贫血CD41/42和α‑地中海贫血‑SEA的引物对及探针；所述β‑地中海贫血CD41/42的引物对为序列1和序列2，探针为序列3和序列4；所述α‑地中海贫血‑SEA的引物对为序列5和序列6或者序列5和序列7，探针为序列8和序列9；本发明专利技术还提供检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法，包括以下步骤：S1收集样品并提取DNA；S2利用一种引物对和探针进行扩增反应；S3检测荧光强度，确定基因型；S4利用另外一种引物对和探针重复上述过程；本发明专利技术的有益效果是：通过设计的引物对及探针，和同种两类引物对，增强荧光检测准确性；通过采提取孕妇血浆和囊胚培养基的游离DNA，实现快速准确无害检测。

【技术实现步骤摘要】
检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法
本专利技术涉及基因检测
，具体是检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法。
技术介绍
地中海贫血是一种因珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病，包括α地中海贫血和β地中海还贫血两种。我国以南方地区多见，尤以广东、广西和海南最多，是长江以南各省份发病率最高，影响最大的单基因疾病。我们将研究重点放在最常见的突变上，β-地中海贫血中的β-珠蛋白基因的突变即密码子41/42处的四个核苷酸(–CTTT)缺失，HBB:c.126delcttt(CD41/42)。CD41/42突变在中国广西、广东、海南和四川等地的所有β地中海贫血突变中发病率最高，分别占所有β地中海贫血等位基因的36.4％、42.5％、73.7％和33.33％。α-地中海贫血中的α-珠蛋白的SEA-缺失突变，SEA缺失突变占所有α-地中海贫血突变中的最高比例，约为68.06％。目前地贫尚无有效的治疗方法，重度α地贫儿一般在出生的24～48小时之内死亡，重度β地贫儿和部分中间型α地贫儿在出生后3-6个月开始出现贫血症状并进行性加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测地中海贫血基因的引物对和探针，其特征在于：包括β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的两者的引物对及探针；所述的β-地中海贫血CD41/42的引物对为：/nHBB上游引物：5’-TTTTCCCACCCTTAGGCTGC-3’(序列1)；/nHBB下游引物：5’-ACAGCATCAGGAGTGGACAGATC-3’(序列2)；/n对应的所述的β-地中海贫血CD41/42的探针为：/n野生型β-珠蛋白：VIC-CAGAGGTTCTTTGAGTCCT-MGBNFQ(序列3)，/n突变CD41/42缺失型：FAM-AGAGGTTGAGTCCTT-MGBNFQ(序列4)；/n所述的...

【技术特征摘要】
1.检测地中海贫血基因的引物对和探针，其特征在于：包括β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的两者的引物对及探针；所述的β-地中海贫血CD41/42的引物对为：
HBB上游引物：5’-TTTTCCCACCCTTAGGCTGC-3’(序列1)；
HBB下游引物：5’-ACAGCATCAGGAGTGGACAGATC-3’(序列2)；
对应的所述的β-地中海贫血CD41/42的探针为：
野生型β-珠蛋白：VIC-CAGAGGTTCTTTGAGTCCT-MGBNFQ(序列3)，
突变CD41/42缺失型：FAM-AGAGGTTGAGTCCTT-MGBNFQ(序列4)；
所述的α-地中海贫血-SEA的引物对为：
HBA上游引物：5’-TCGGTCGTCCCCACTGT-3’(序列5)；
HBA下游引物Ⅰ：5’-GGACTGCTCCGCTCCAC-3’(序列6)；
HBA下游引物Ⅱ：5’-CAGCCTTGAACTCCTGGACTTAA-3’(序列7)；
对应的所述的α-地中海贫血-SEA的探针为：
野生型α-珠蛋白：FAM-TCTAGCCCCTGAGCACCG-MGBNFQ(序列8)；
突变SEA缺失型：VIC-CTCCAAGTGAACCTCC-MGBNFQ(序列9)。


2.根据权利要求1所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针，其特征在于：所述的HBA下游引物Ⅰ为设计的野生型α-珠蛋白的引物；所述的HBA下游引物Ⅱ为设计的突变SEA缺失型的引物；所述的HBA下游引物Ⅰ与所述的HBA上游引物构成HBA野生型α-珠蛋白的引物对，对应的所述的HBA下游引物Ⅱ与所述的HBA上游引物构成HBA突变SEA缺失型的引物对。


3.根据权利要求1所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1～2任一项所述的探针组和引物对，以及其他试剂；所述的其他试剂包括水、dNTPs、DNA聚合酶、数字PCR反应缓冲液、微滴生成油、阳性参考品、阴性参考品和标准品中的一种或多种。


4.根据权利要求1所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1收集包括孕妇外周血浆以及囊胚移植后弃置的囊胚培养基为待检测样品，先将囊胚培养基进行预处理，再分别提取外周血浆和囊胚培养基中的游离DNA；
S2将提取后的DNA按照来源分为血浆中的游离DNA以及囊胚培养基中的游离DNA，采用β-地中海贫血CD41/42的引物对和探针，以血浆的游离DNA以及囊胚培养基的DNA为模板分别进行微滴数字PCR的扩增反应，得到扩增后的产物；
S3将得到的扩增产物进行检测荧光强度，确定基因型；
S4采用α-地中海贫血-SEA的引物对及探针重复上述S2-S3的过程，即为引物对和探针的使用方法。


5.根据权利要求4所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法，其特征在于：所述的囊胚培养基的预处理，包括以下步骤：
(1)通过裂解液以及裂解酶进行囊胚培养基的裂解，得到囊胚培养基的裂解产物；(2)利用β-地中海贫血CD41/42的引物对或α-地中海贫血-SEA的引物对进行囊胚培养基裂解产物的预扩增，得到预扩增产物。


6.根据权利要求5所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法，其特征在于：所述的提取囊胚培养基中的游离DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲婷，沙郁林，李鹏昊，张素娟，周姝伶，刘敬，钟影，顾江，
申请(专利权)人：成都锦欣生殖医学与遗传学研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51