一种双链RNA的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种双链RNA在制备抗虫剂或培育抗虫的转基因植物中的应用。本发明专利技术还提供了一种包含双链RNA的载体或重组菌株。本发明专利技术提供的双链RNA、包含双链RNA的载体或重组菌株，可以明显干扰害虫的取食能力，抑制其危害植物，有效的培育出抗虫的转基因植物。同时，所述的双链RNA、载体或重组菌株无污染，也不会将有害物质传递到害虫的天敌体内，与环境相容性好。

【技术实现步骤摘要】
一种双链RNA的应用
本专利技术涉及一种基因工程
，具体涉及一种双链RNA及其在制备抗虫剂或转基因植物培育中的应用。
技术介绍
神经肽是一类小分子活性多肽，主要由神经分泌细胞(Enteroendocrinecells,EEs)或神经元(Neuron)产生，某种程度上具有较高的相似性：基因转录翻译后首先形成前导前体蛋白(Pre-pro-proteins)，N端16-30氨基酸残基组成前体蛋白(Precursors)，形成具有疏水结构的信号肽，前体蛋白(Precursors)在其识别与引导下运送至内质网进行正确折叠(EndoplasmicReticulum，ER)，前体多肽在内质网内经历一系列翻译后修饰(糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成)，接着进入高尔基体后，氨基酸单个或者相邻的两个位点被蛋白酶切割，C-末端碱性残基由羧肽酶转化酶切除，形成具有生物活性的成熟多肽，随后通过各种代谢途径分泌到胞外，达到靶位点，与蛋白受体特别是G蛋白偶联受体(GProtein-coupledReceptor，GPCR)，参与各种生理活动。短神经肽(shortNPF)，也称sNPF就是其中众多神经肽的一种，在昆虫中主要参与多种重要的生理和行为活动，如痛觉、睡眠、取食、代谢、学习与记忆乃至神经系统本身的分化和发育，在不同发育期还可调节保幼激素的合成，对保幼激素合成具有一定的抑制作用。棉铃虫属于鳞翅目、夜蛾科，主要以幼虫取食幼嫩组织为害作物，以蛹越冬。此外，棉铃虫具有显著的生理生态及行为特点，例如杂食性、滞育、迁飞等，还是研究鳞翅目昆虫的代表物种。为防治作物的虫害，专利CN110679571A公开了一种棉花种植用高效灭虫灯，该灭虫灯通过改变高压电网的结构，并利用电动马达带动旋转，网栅和网罩主动性靠近接触灯管周围的昆虫，增加害虫触网概率，提高灭杀效率。专利CN110558193A公开了一种高产低害的棉花种植方法，包括选种育苗、苗床管理、移栽、田间管理、收获，该种植方法通过对棉花种子的合理处理强化以及对棉花植株的有效抗病防害，大大提高了棉花苗期的存活率和抗病性，虫害率降低了25％以上。专利CN105967896A公开了一种棉花种植用的抗病虫营养液，该营养液能够增强棉花的抗病虫能力，提高棉花的免疫能力，促进棉花植株的根系发达等等。但是，上述现有技术中，并没有解决针对特定害虫的防治措施，有些方法的使用还会导致环境不相容。
技术实现思路
为解决现有技术中的问题，本专利技术的目的是提供一种RNAi干扰载体或双链RNA，并将其应用于培育抗虫的转基因植物。具体的：本专利技术的第一方面，提供了一种双链RNA在制备抗虫剂或培育抗虫的转基因植物中的应用，所述的双链RNA包含SEQIDNO：22所示的核苷酸序列。本专利技术的第二方面，提供了一种包含双链RNA的载体或重组菌株，所述的双链RNA包含SEQIDNO：22所示的核苷酸序列。优选的，所述的载体包括但不限于pDNR-LIB载体。优选的，所述的载体包含SEQIDNO：20所示的核苷酸序列。优选的，所述的重组菌株包括但不限于农杆菌或大肠杆菌。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的菌株为大肠杆菌DH5α或C58农杆菌。本专利技术的第三方面，提供了一种包含双链RNA、载体或重组菌株的试剂盒、细胞系、植株或其叶片。优选的，所述的植株为单子叶植物或双子叶植物。在本专利技术的一个具体实施方式中为棉花植株。本专利技术的第四方面，提供了一种双链RNA的制备方法，所述的制备方法包括采用靶向靶序列SEQIDNO：3和/或SEQIDNO：4的引物，扩增棉铃虫sNPF基因的cDNA序列，合成双链RNA。优选的，先采用引物SEQIDNO：14、SEQIDNO：15，再采用引物SEQIDNO：12和SEQIDNO：13扩增棉铃虫sNPF基因的cDNA序列，合成双链RNA。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括：获取棉铃虫sNPF基因的总RNA，反转录获得cDNA；优选为棉铃虫肠总RNA或脑总RNA，进一步优选为肠总RNA；扩增所述的cDNA；优选扩增引物为SEQIDNO：10、11；将扩增获得的cDNA连接至载体后，转入细胞，提取质粒；采用靶向靶序列SEQIDNO：3和/或SEQIDNO：4的引物，扩增提取的质粒，合成双链RNA；优选先采用引物SEQIDNO：14和SEQIDNO：15，然后采用引物SEQIDNO：12和SEQIDNO：13扩增提取的质粒，合成双链RNA。本专利技术的第五方面，提供了一种包含双链RNA核苷酸序列的RNAi干扰载体的制备方法，所述的制备方法包括采用上游引物：包含酶切位点I、酶切位点II和SEQIDNO：10，下游引物：包含酶切位点III、酶切位点IV和SEQIDNO：11，扩增棉铃虫sNPF基因的cDNA，然后经酶切与载体连接获得RNAi干扰载体。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括：获取棉铃虫sNPF基因的总RNA，反转录获得cDNA；优选为棉铃虫肠总RNA或脑总RNA，进一步优选为肠总RNA；采用上游引物：包含酶切位点I、酶切位点II和SEQIDNO：10，下游引物：包含酶切位点III、酶切位点IV和SEQIDNO：11，扩增cDNA，获得扩增产物；优选酶切位点I为SmaI识别位点、酶切位点II为EcoRI识别位点、酶切位点III为BamHI识别位点、酶切位点IV为HindIII识别位点；进一步优选采用引物SEQIDNO：18、19扩增cDNA；用酶切位点I对应的酶与酶切位点III对应的酶双酶切获得的扩增产物，获得目的片段1。用酶切位点I对应的酶与酶切位点III对应的酶双酶切载体，获得载体骨架1；优选载体为pGreen-HY104。将获得的目的片段1连接至载体骨架1上，获得重组质粒1。用酶切位点II对应的酶与酶切位点IV对应的酶双酶切获得的扩增产物，获得目的片段2。用酶切位点II对应的酶与酶切位点IV对应的酶双酶切获得的重组质粒1，获得载体骨架2。将获得的目的片段2连接至载体骨架2上，获得RNAi干扰载体。优选的，所述的RNAi干扰载体或包含双链RNA的载体，其具有特异DNA片段。所述的特异DNA片段包括DNA片段甲、DNA片段乙以及DNA片段甲与DNA片段乙之间的间隔序列，其中，DNA片段甲与DNA片段乙的序列反向互补。进一步优选的，所述的RNAi干扰载体或包含双链RNA的载体，为采用骨架载体连接的DNA片段甲和DNA片段乙。本专利技术的第六方面，提供了一种棉铃虫sNPF基因的cDNA文库或获取棉铃虫sNPF基因的cDNA的构建方法，包括：1)取棉铃虫sNPF基因的总RNA，反转录获得cDNA；优选为棉铃虫肠总RNA或脑总RNA，进一步优选为肠总RNA。2)扩增cDNA5'RACE扩增引物为SEQIDNO：5、6；优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双链RNA在制备抗虫剂或培育抗虫的转基因植物中的应用，其特征在于，所述的双链RNA包含SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种双链RNA在制备抗虫剂或培育抗虫的转基因植物中的应用，其特征在于，所述的双链RNA包含SEQIDNO：22所示的核苷酸序列。


2.一种包含双链RNA的载体或重组菌株，其特征在于，所述的双链RNA包含SEQIDNO：22所示的核苷酸序列。


3.根据权利要求2所述的载体或重组菌株，其特征在于，所述的载体包含SEQIDNO：20所示的核苷酸序列。


4.一种双链RNA的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括采用靶向靶序列SEQIDNO：3和/或SEQIDNO：4的引物，扩增棉铃虫sNPF基因的cDNA序列，合成双链RNA。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
获取棉铃虫sNPF基因的总RNA，反转录获得cDNA；优选为棉铃虫肠总RNA或脑总RNA，进一步优选为肠总RNA；
扩增所述的cDNA；优选扩增引物为SEQIDNO：10、11；
将扩增获得的cDNA连接至载体后，转入细胞，提取质粒；
采用靶向靶序列SEQIDNO：3和/或SEQIDNO：4的引物，扩增提取的质粒，合成双链RNA；优选先采用引物SEQIDNO：14和SEQIDNO：15，然后采用引物SEQIDNO：12和SEQIDNO：13扩增提取的质粒，合成双链RNA。


6.一种包含双链RNA核苷酸序列的RNAi干扰载体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括采用上游引物：包含酶切位点I、酶切位点II和SEQIDNO：10，下游引物：包含酶切位点III、酶切位点IV和SEQIDNO：11，扩增棉铃虫sNPF基因的cDNA，然后经酶切与载体连接获得RNAi干扰载体。


7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓光，那日松，张立新，赵熹，刘佳，
申请(专利权)人：江苏仁明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32