一种核酸跨膜运输载体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种核酸跨膜运输载体及其制备方法。所述的核酸跨膜运输载体由原料和负载药物组成，所述原料包括脂肪酸改性壳聚糖和胆固醇，所述负载药物为核酸类物质。由于壳聚糖分子上含有大量的氨基，利用界面反应在壳聚糖结构单元上引入长链疏水基团；从而使改性后的壳聚糖同时具有亲水基团（氨基糖区域）和双亲性基团（糖酯区域）；脂肪酸改性壳聚糖中氨基糖区域氨基的pka在6.5以下，能够为核酸类物质提供亲和性高的结合区域；而脂肪酸改性壳聚糖中的糖酯区域趋向于形成棒状胶团或层状胶团结构，从而使核酸类物质得到物理保护。棒状胶团或层状胶团结构在接近细胞膜时则容易发生翻转，从而易于插入细胞膜，为核酸类物质的跨膜运输提供动力。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸跨膜运输载体及其制备方法
本专利技术涉及核酸类药物传递体的领域。具体地，本专利技术提供了具有“氨基糖区域”以及“糖酯区域”的脂肪酸改性壳聚糖的制备方法，以及有利于核酸的体内递送的组合物的组成。此外，本专利技术提供了制备此类组合物的方法以及测定此类组合物在生理环境中的稳定性的方法，可用于多种疾病的治疗。
技术介绍
治疗性核酸包括例如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒和免疫刺激性核酸。此类核酸通过多种机制起作用。RNAi的治疗性应用极其广泛，因为siRNA和miRNA构建体可用针对靶蛋白质的任何核酸序列合成。迄今为止，siRNA构建体在体外和体内模型中都已显示出特异性下调靶蛋白质的能力。然而，目前治疗性核酸的临床应用还面临的两个问题：首先，容易被血浆中的核酸酶水解；其次，进入细胞内部的能力有限。针对核酸酶水解的问题，目前通常的办法是通过化学修饰的方式来掩盖核酸的酶切部位(例如硫代磷酸酯基团修饰)。例如，研究人员使用硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯键合核苷酸间的磷酸二酯键；UhlmannE等人对核苷酸的碱基(例如，5-丙炔基-嘧啶)或糖(例如，2'-修饰的糖)进行修饰(Antisense:ChemicalModifications.EncyclopediaofCancer,第X卷，pp64-81AcademicPressInc.(1997))；另外，研究人员还利用2'-5'糖苷键来提高核酸的稳定性(US5532130)。然而，这些化学修饰在使治疗性核酸免受核酸酶水解的同时降低了该治疗性核酸的活性。其次，治疗性核酸向细胞内传递可通过使用载体系统(例如聚合物、阳离子脂质)或通过化学修饰构建体(例如通过与胆固醇分子共价结合)来进行促进。为了尝试提高功效，研究者也已利用基于脂质的载体系统递送化学修饰的或未修饰的治疗性核酸。目前阴离子(常规的)脂质体、pH敏感性脂质体、免疫脂质体、膜融合脂质体(fusogenicliposome)和阳离子脂质/反义聚集体已经得到了一定的应用。尽管取得最新的进展，但本领域内仍然存在对适合于常规治疗用途的改进的组合物的需要。首先，待专利技术的组合物要具有更好的生物相容性以降低额外的免疫反应的发生；其次，该组合物可以以较高效率封装核酸，具有高的包封率，保护封装的核酸在血清中免受降解和清除，适合于全身性递送，并且提供封装的核酸的细胞内递送；再次，该组合物应具有合理的价格区间，从而能够惠及到更多的受众。有鉴于此，特提出本专利技术，本专利技术提供了符合上述要求的新型组合物、制备所述组合物的方法以及使用所述组合物将核酸引入细胞的方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种核酸跨膜运输载体及其制备方法，其组合物为脂肪酸改性壳聚糖、胆固醇和核酸类物质。由于壳聚糖分子上含有大量的氨基，利用界面反应在壳聚糖结构单元上引入长链疏水基团；从而使改性后的壳聚糖同时具有亲水基团(氨基糖区域)和双亲性基团(糖酯区域)；脂肪酸改性壳聚糖中氨基糖区域氨基的pka在6.5以下，能够为核酸类物质提供亲和性高的结合区域；而脂肪酸改性壳聚糖中的糖酯区域趋向于形成棒状胶团或层状胶团结构，从而使核酸类物质得到物理保护。而散的多股螺旋结构在接近细胞膜时则容易发生翻转，从而易于插入细胞膜，为核酸类物质的跨膜运输提供动力。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种核酸跨膜运输载体，所述的核酸跨膜运输载体由原料和负载药物组成，所述原料包括脂肪酸改性壳聚糖和胆固醇，所述负载药物为核酸类物质；所述脂肪酸改性壳聚糖由“糖酯区域”和“氨基糖区域”构成，如下：所述的核酸跨膜运输载体的制备方法，包括如下步骤：1)脂肪酸改性壳聚糖的制备：所述脂肪酸改性壳聚糖由壳聚糖与脂肪酸在酸性水溶液以及有机溶剂A组成的混合液中，活化剂以及缚酸剂的存在下反应得到；2)核酸跨膜运输载体的制备：所述的核酸跨膜运输载体由脂肪酸改性壳聚糖、胆固醇以及待包封的核酸类物质，利用挤出法获得。具体包括如下步骤：(1)将壳聚糖溶于乙酸溶液中，然后加入溶有缚酸剂、活化剂和脂肪酸的有机溶剂A，搅拌反应3小时，有机相旋转蒸发至干，洗涤、冷冻干燥至恒重，得到淡黄色脂肪酸改性壳聚糖；本专利技术采用界面反应的方式进行，酰化反应优先发生于水与有机溶剂A的界面上的壳聚糖上的氨基基团，生成的脂肪酸改性壳聚糖分布于界面周围，能够使得周边的氨基更容易发生酰化反应，使得发生脂肪酸改性的壳聚糖区间非常集中。(2)将步骤(1)得到的脂肪酸改性壳聚糖以及适量胆固醇溶于有机溶剂B，加入待包封的核酸类物质溶液，乳化得到W/O初乳，将W/O初乳加入到10倍体积的水中混合，乳化得到W/O/W乳液，利用旋转蒸发去除有机溶剂，利用挤出法制备得到核酸跨膜运输载体。进一步，所述步骤(1)中的有机溶剂A为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸甲酯中的一种。进一步，所述步骤(1)中的壳聚糖分子量为10000-100000。进一步，所述步骤(1)中的脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸中的一种或几种的混合物；所述活化剂为甲酰氯、乙酰氯、氯化亚砜、光气、三光气、DCC中的一种；所述的缚酸剂为三乙胺、三甲胺、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种。进一步，所述步骤(1)中的壳聚糖、脂肪酸、活化剂以及缚酸剂的摩尔比为：(0.1～1.0):1.0:1.5:2.0，优选为0.2～0.8:1.0:1.5:2.0。进一步，所述步骤(2)中的有机溶剂B为甲醇、乙醇、丙酮、丁酮中的一种。进一步，所述步骤(2)中的脂肪酸改性壳聚糖、胆固醇以及核酸类物质的质量比为：(2.0～10.0):(0.1～1.0):1，优选为(4.0～8.0):(0.2～0.5):1。进一步，所述步骤(2)中的核酸类物质为siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、免疫刺激性核酸或U1接头。根据本专利技术，典型的制备方法包括如下步骤：A、精密称取一定量壳聚糖，溶于1％的乙酸溶液中，转移至三口烧瓶中，置于低温冷机中，低速搅拌的条件下，低温下缓慢滴加溶有缚酸剂、活化剂和脂肪酸的有机溶剂A，全部滴加完毕，搅拌反应3小时。后处理条件如下：首先分出水相，水相用适量溶剂A洗涤两次，合并有机相，旋转蒸发至干，用适量水洗涤多次，过滤并冷冻干燥至恒重，即得到淡黄色脂肪酸改性壳聚糖。B、将步骤A得到的脂肪酸改性壳聚糖以及适量胆固醇溶于有机溶剂B，加入待包封的核酸类物质溶液，乳化得到W/O初乳，将初乳加入到10倍体积的水中混合，乳化得到W/O/W乳液。利用旋转蒸发去除有机溶剂，利用挤出法制备得到核酸跨膜运输载体。本专利技术的有益效果：1)对于核酸载体的合成设计以脂肪酸和壳聚糖为主要原料，无毒无害、生物相容性好，且可以生物降解，具有非常高的环境友好性；2)利用界面反应在壳聚糖结构单元上引入长链疏水基团；从而使改性后的壳聚糖同时具有亲水基团(氨基糖区域)和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸跨膜运输载体，其特征在于：所述的核酸跨膜运输载体由原料和负载药物组成，所述原料包括脂肪酸改性壳聚糖和胆固醇，所述负载药物为核酸类物质；所述脂肪酸改性壳聚糖由“糖酯区域”和“氨基糖区域”构成。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸跨膜运输载体，其特征在于：所述的核酸跨膜运输载体由原料和负载药物组成，所述原料包括脂肪酸改性壳聚糖和胆固醇，所述负载药物为核酸类物质；所述脂肪酸改性壳聚糖由“糖酯区域”和“氨基糖区域”构成。


2.根据权利要求1所述的核酸跨膜运输载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）脂肪酸改性壳聚糖的制备：所述脂肪酸改性壳聚糖由壳聚糖与脂肪酸在酸性水溶液以及有机溶剂A组成的混合液中，活化剂以及缚酸剂的存在下反应得到；
2）核酸跨膜运输载体的制备：所述的核酸跨膜运输载体由脂肪酸改性壳聚糖、胆固醇以及待包封的核酸类物质，利用挤出法获得。


3.根据权利要求2所述的核酸跨膜运输载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将壳聚糖溶于乙酸溶液中，然后滴加溶有缚酸剂、活化剂和脂肪酸的有机溶剂A，搅拌反应3小时，有机相旋转蒸发至干，洗涤、冷冻干燥至恒重，得到淡黄色脂肪酸改性壳聚糖；
（2）将步骤（1）得到的脂肪酸改性壳聚糖以及适量胆固醇溶于有机溶剂B，加入待包封的核酸类物质溶液，乳化得到W/O初乳，将W/O初乳加入到10倍体积的水中混合，乳化得到W/O/W乳液，利用旋转蒸发去除有机溶剂，利用挤出法制备得到核酸跨膜运输载体。


4.根据权利要求1所述的核酸跨膜运输载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的有机溶剂A为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸甲酯中的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳，张立新，那日松，刘晓光，赵熹，冯献礼，丁胜利，
申请(专利权)人：江苏仁明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32