一种嗜热真菌甘露聚糖酶的生产方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种甘露聚糖酶的生产方法及其应用。本发明专利技术所提供的生产甘露聚糖酶的方法，包括：将来源于樟绒枝霉S168的甘露聚糖酶基因导入受体酵母，得重组酵母；对所述重组酵母依次进行基础发酵培养、甘油补料发酵阶段和甲醇补料诱导表达阶段，从发酵产物中获得甘露聚糖酶。本发明专利技术工程菌经高密度发酵甘露聚糖酶表达水平达42200U/mL，制得的酶最适pH为7.5，最适温度为75℃，具耐酸碱、热稳定性好、水解特性优异的特点，另外本发明专利技术拓宽了甘露聚糖酶的应用范围，利用该酶制备得到的部分水解魔芋胶在食品、饲料等行业中具有很大的应用价值，丰富了益生元产品种类，推动了我国益生元产业的发展，具有较大的社会和经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种嗜热真菌甘露聚糖酶的生产方法及其应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种嗜热真菌甘露聚糖酶的生产方法及其应用。
技术介绍
甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是一种特异性水解甘露聚糖中β-1,4-甘露糖苷键的内切水解酶。根据其氨基酸序列的相似性，甘露聚糖酶可以分为糖苷水解酶5、26、113和134家族。作为一种重要的糖苷水解酶，甘露聚糖酶能够水解不同种类的甘露聚糖(线性甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖)产生低聚合度的甘露寡糖(SrivastavaandKapoor.BiotechnologyAdvances,2017,35:1-19)。因此，甘露聚糖酶已经广泛应用于食品、饲料等多种行业中(Chauhanetal.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2012,93:1817-1830)。甘露聚糖酶来源广泛，在许多微生物、植物和低等动物中均有发现。提高甘露聚糖酶的表达水平，扩大甘露聚糖酶的来源，发掘甘露聚糖酶的更多应用，仍是目前研究的热点。膳食纤维通常是指不被人体消化吸收的一类多糖，主要包括菊粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产甘露聚糖酶的方法，包括如下步骤：/n(A)将来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的编码基因导入受体酵母，得到重组酵母；/n(B)按照如下步骤对所述重组酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得甘露聚糖酶：/nB1)基础发酵培养：将所述重组酵母接种于BSM培养基中培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段；/nB2)甘油补料发酵阶段：在步骤B1)的基础上，将甘油以18.4mL/h/L起始发酵液的速度流加到发酵体系中，直至发酵液在600nm处的吸光值达到180-220，饥饿0.5h，然后进行甲醇补料诱导表达阶段；/nB3)甲醇补料诱导表达阶段：在步骤B2)的基础上，将甲醇加流到发酵体系中，4h内使流速从3...

【技术特征摘要】
1.一种生产甘露聚糖酶的方法，包括如下步骤：
(A)将来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的编码基因导入受体酵母，得到重组酵母；
(B)按照如下步骤对所述重组酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得甘露聚糖酶：
B1)基础发酵培养：将所述重组酵母接种于BSM培养基中培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段；
B2)甘油补料发酵阶段：在步骤B1)的基础上，将甘油以18.4mL/h/L起始发酵液的速度流加到发酵体系中，直至发酵液在600nm处的吸光值达到180-220，饥饿0.5h，然后进行甲醇补料诱导表达阶段；
B3)甲醇补料诱导表达阶段：在步骤B2)的基础上，将甲醇加流到发酵体系中，4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液增加至10.9mL/h/L起始发酵液，然后维持10.9mL/h/L起始发酵液速度流加甲醇至发酵结束。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶为来源于樟绒枝霉S168的甘露聚糖酶；
进一步地，所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶为如下任一所示蛋白质：
a1)SEQIDNo.1自N末端第18至355位氨基酸残基组成的蛋白质；
a2)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a3)将a1)或a2)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有甘露聚糖酶活性的蛋白质；
a4)与a1)-a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有甘露聚糖酶活性的蛋白质；
a5)在a1)-a4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的编码基因是通过重组载体的形式导入所述受体酵母中的；
进一步地，所述重组载体为将所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的编码基因插入到pPIC9K载体的多克隆位点后得到的重组质粒。


4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述酵母为毕赤酵母；
进一步地，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。


5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于樟绒枝霉S168的甘露聚糖酶的编码基因为如下任一所述的DNA分子：
b1)SEQIDNo.2的自5′末端第52-1068位所示的DNA分子；
b2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的DNA分子杂交且编码所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的DNA分子；
b4)与b1)-b3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的DNA分子。


6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤B1)中，接种于所述BSM培养基中的所述重组酵母为所述重组酵母的种子液；
进一步地，所述种子液按照包括如下步骤的方法制备得到：将步骤(A)所得的重组酵母接种于BMGY培养基，在30℃、200rpm振荡培养至发酵液在600nm处吸光值达到10；
和/或
步骤B1)中，将所述种子液接种于所述BSM培养基为接种...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫巧娟，李延啸，江正强，刘瑜，杨绍青，刘军，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11