一种结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物制造技术

本发明专利技术提供了一种经非天然氨基酸修饰的结合免疫抑制分子PD‑L1的蛋白药物，其通过有潜在生物活性的非天然氨基酸整合到共价蛋白药物中，通过可接近反应与靶蛋白结合，非天然氨基酸可以与靶蛋白氨基酸残基共价结合。经过非天然氨基酸修饰的PD‑1提高了与PD‑L1的结合能力，且具有抑制癌细胞的作用，具有治疗肿瘤的功效。

【技术实现步骤摘要】
一种结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物
本专利技术属于医学科学
，涉及一种结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物。
技术介绍
随着生物技术的发展，恶性肿瘤的治疗手段不断的提升，除了传统的治疗手段如手术治疗，化疗和放疗有了重大突破；在药物开发方面，新型药物更新迭代速度不断加快。在肿瘤免疫治疗领域，免疫激活和抑制通路的相关药物初步显示了其应用前景，如免疫检查点抑制剂，PD1-PD-L1，CTLA4，TIM3，LAG3等抑制剂。在实体瘤免疫微环境中，肿瘤细胞或者肿瘤诱导的相关抑制性免疫细胞，正是通过免疫系统的刹车作用来抵抗免疫治疗，使免疫疗法在实体瘤中疗效大大降低。共价分子药物在药物开发方面有其优势：如更强的生化效应，更长的半衰期，更优的治疗指数，更牢的靶向结合等，因此，共价小分子药物成为近几年药物开发的热点。然而，共价蛋白药物的开发却一直未取得有效进展。在免疫检查点受体与配体相互作用之间引入共价结合是一种新的药物开发形式，为免疫治疗带来新的思路。PD1是表达在T细胞表面的抑制性受体，能够结合表达在肿瘤或者相关调节性免疫细胞中的配体如PD-L1，PDL2等，激活T细胞胞内区抑制性信号，避免T细胞过度活化。PD1-PD-L1的相互作用亦是肿瘤细胞免疫逃避的重要途径之一，是影响免疫治疗的关键因素。目前市场上已经有多种针对PD1/PD-L1通路的抑制性抗体，并在多数实体瘤中显示一定的疗效。利用PD1作为天然蛋白具有封闭肿瘤细胞表面的PD-L1的成药潜力，然而天然蛋白对于配体的结合具有一定可逆性，利用非天然氨基酸来改造天然PD1蛋白的氨基酸残基，使之能与配体以共价键结合的方式结合，则能提高非天然蛋白药物的结合能力，有效逆转PD-L1的抑制作用。
技术实现思路
为了提高PD1与PD-L1的结合力，通过分析PD1-PD-L1复合体的晶体结构，我们对野生型PD1胞外域进行非天然氨基酸(fluorosulfate-L-tyrosine，FSY)修饰，开发一个由非天然氨基酸插入的功能性药物PD1FSY，用于共价结合PD-L1分子并阻断PD-L1的免疫抑制信号。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物，所述蛋白药物经非天然氨基酸修饰。优选地，所述蛋白药物为PD-1。优选地，所述PD-1修饰位点为PD1分子上的A129、Q75或D77其中一个位点。优选地，所述非天然氨基酸为氟代硫酸盐-L-酪氨酸。本专利技术还提供如上所述的结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物在制备治疗肿瘤或免疫治疗药物中的应用。优选地，所述肿瘤包括肺癌或/和脑胶质肿瘤。具体地，本专利技术通过以下方式实现：首先，验证PD1FSY蛋白药物与其靶点PD-L1蛋白结合的可逆性，通过PD1FSY蛋白药物与PD-L1蛋白孵育，经高温裂解和变性，westernblot检验蛋白交联情况；进一步地，验证PD1FSY蛋白与肿瘤细胞PD-L1分子结合的可逆性，通过PD1FSY蛋白药物与细胞孵育，收集细胞，提取蛋白质，经高温裂解和变性，westernblot检验蛋白交联情况；经一步地，验证PD1FSY蛋白与肿瘤组织中PD-L1分子结合的可逆性，在移植肿瘤小鼠中注射蛋白药物PD1FSY，收集肿瘤，提取蛋白质，经高温裂解和变性，westernblot检验蛋白交联情况；为了验证PD1FSY用于肿瘤免疫治疗的疗效，我们首先利用PBMC小鼠肿瘤模型，在移植肿瘤的小鼠中注射蛋白药物，评价蛋白药物对肿瘤生长的抑制情况，进一步地，为了验证PD1FSY在一个免疫系统完整的小鼠肿瘤模型中的疗效，我们构建免疫系统人源化鼠肿瘤模型，使用蛋白药物治疗，评价蛋白药物对肿瘤的生长抑制情况。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种经非天然氨基酸修饰的结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物，其通过有潜在生物活性的非天然氨基酸整合到共价蛋白药物中，通过可接近反应与靶蛋白结合，非天然氨基酸可以与靶蛋白氨基酸残基共价结合。经过非天然氨基酸修饰的PD-1提高了与PD-L1的结合能力，且具有抑制癌细胞的作用，具有治疗肿瘤的功效。附图说明图1为本专利技术共价蛋白药物设计概念图(A为共价蛋白药物设计的原理图，由图可以看出，有潜在生物活性的非天然氨基酸(latentbioreactiveUaa)整合到共价蛋白药物中，通过可接近反应(proximity-enabledreactivity)与靶蛋白结合，非天然氨基酸可以与靶蛋白氨基酸残基共价结合；B为非天然氨基酸FSY与PDL1的组氨酸发生六价硫氟交换反应(sulfur-fluorideexchangereaction,SuFEx)，形成共价结合酪氨酸-组氨酸；C图为人PD1/PD-L1晶体结构示意图，PD1分子上的A129,Q75,D77位点用于FSY修饰，其潜在结合位点在于PD-L1分子上的His69或Lys124位点。图2为PD1及其非天然氨基酸修饰蛋白与PD-L1分子的共价结合，左边为考马斯亮蓝染色，右边为抗蛋白标签Hiswesternblot结果。(由图可以看出，PD1(A129FSY)修饰变体对于PD-L1由较好的共价交联效率，可用于下一步实验)图3为PD1(A129FSY)与H460细胞和U87细胞的PD-L1分子共价交联效果图，(由图可以看出，PD1(A129FSY)能够共价交联肿瘤细胞的PD-L1分子，其交联效率与蛋白药物浓度有关，并且野生型PD1不能与PD-L1形成共价交联)图4为PD1(A129FSY)与小鼠H460肿瘤和U87肿瘤的PD-L1分子共价交联效果图，药物进入方式分别为静脉注射(左)和癌旁注射(右)，(由图4可以看出，PD1(A129FSY)能够共价交联小鼠体内肿瘤组织的PD-L1分子，其交联效率与蛋白药物浓度有关，并且野生型PD1不能与PD-L1形成共价交联)图5为蛋白药物PD1(A129FSY)，PD1(WT)，阳性抗体药(Aterolizumab)在PBMC肿瘤模型中对肿瘤生长抑制的生长曲线(左)与肿瘤照片(右)，(由图可以看出，阳性抗体药与PD1(A129FSY)具有高效的抑制肿瘤的作用，效果明显，PD1(WT)对于PBMC肿瘤效果较差)图6为实施例中蛋白药物在人源化鼠实体瘤模型中有效性评价实验(图A为实验流程，图B为对照组PBS，实验组PD-1(WT)，PD-1(FSY22ug),PD-1(FSY200ug),Atezolizumab用药后的肿瘤生长曲线，图C为对照组及实验组用药后的肿瘤图像，图D为对照组及实验组用药后的肿瘤质量统计表)。由结果可以看出，天然药物PD1，抗PD-L1抗体(Atezolizumab),共价蛋白药物PD1(A129FSY)的抗肿瘤效果均能在免疫系统人源化鼠实体瘤模型中得到验证，具有较好抑制肿瘤的效果，并且共价蛋白药物PD1(A129FSY)在免疫系统人源化鼠肿瘤中的效果优于阳性抗体药物。具体实施方式为了更加简洁明了的展本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物，其特征在于，所述蛋白药物经非天然氨基酸修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物，其特征在于，所述蛋白药物经非天然氨基酸修饰。


2.如权利要求1所述的结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物，其特征在于，所述蛋白药物为PD-1。


3.如权利要求2所述的结合免疫抑制分子PD-L1的蛋白药物，其特征在于，所述PD-1修饰位点为PD1分子上的A129、Q75或D77其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐洋，王磊，陈渠，
申请(专利权)人：广东圣赛生物科技有限公司，南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44