一种牡丹籽粕ACE抑制肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种牡丹籽粕ACE抑制肽及其制备方法。所述ACE抑制肽的氨基酸序列为Val‑Leu‑Ser‑Gly‑Phe（VLSGF），体外实验表明，该多肽具有良好的ACE抑制活性，IC

【技术实现步骤摘要】
一种牡丹籽粕ACE抑制肽及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种牡丹籽粕ACE抑制肽及其制备方法和应用，属于食品生物

技术介绍
高血压是一种心血管病综合征，也是危及人们心血管疾病的主要因素之一，其常伴随其他病症，如动脉粥样硬化、心肌梗死和中风等。高血压发病的原因一般是遗传和环境因素，当代在饮食习惯、作息规律、精神压力等因素的影响下，高血压病愈发普遍。血管紧张素转换酶（ACE）是一类含锌的二肽羧基肽酶，它主要存在于肺和一些器官中，如脑、心、肝、肾、肠和胎盘中。此外，肺内皮细胞、吸收上皮细胞、神经上皮细胞和附睾细胞等几种细胞中也含有ACE。血管紧张素转换酶在参与高血压调节起到重要的作用，参与肾素-血管紧张素系统（RAS）和激肽释放酶-激肽系统（KKS）。ACE抑制肽的作用原理就是通过抑制或降低ACE酶活性达到降低血管紧张素II（AngII）的生成和避免激肽、缓激肽的失活，起到调节血压的目的。常见的ACE抑制剂药物有卡托普利、苯那普利、依那普利、培哚普利等，但是临床上显示长期服用降压药，会有咳嗽、血管性水肿、头痛等不良反应。因此，目前食源的降压肽研究得到重视，因其具有天然、安全性高、易吸收、无副作用的特点而备受关注。牡丹籽经榨油后的籽粕大多丢弃或者作为动物饲料，其生物利用率低。牡丹籽蛋白含量为18%-35%，具有很高的营养价值。牡丹籽ACE抑制肽生产制备和保存方面的研究开发，能够达到牡丹籽粕蛋白的有效利用的目的，提高牡丹籽的附加价值，实现资源的综合利用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牡丹籽粕ACE抑制肽及其制备方法和应用，提高牡丹籽的附加价值，实现资源的综合利用。为实现上述目的，采用以下技术方案：本专利技术提供一种ACE抑制肽，其氨基酸序列为Val-Leu-Ser-Gly-Phe，缩写为VLSGF，即由缬氨酸-亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸5个氨基酸残基构成。进一步，所述ACE抑制肽可以来自于牡丹籽粕天然提取或人工氨基酸合成。本专利技术提供一种所述ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤，1）牡丹籽粕蛋白酶解产物的制备：牡丹籽粕经粉碎后，经石油醚脱脂干燥后过筛备用。采用碱提酸沉法得到牡丹籽粕蛋白，采用中性蛋白酶将其在以下酶解条件下酶解：底物浓度2%（w/v）、pH7.50、酶添加量7200U/g、温度43℃，酶解时间2h，酶解后沸水浴10min灭活，冷却后调节pH至中性，4℃条件下10000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为牡丹籽粕蛋白质酶解产物。2）牡丹籽粕蛋白的酶解产物利用SephadexG-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3mL/min，测量洗脱组分在214nm波长处的吸光值；收集具有最佳ACE抑制活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离；RP-HPLC的洗脱梯度为0-3min，5%（V/V）乙腈（含0.1%三氟乙酸）；3-43min，5%-40%（V/V）乙腈（含0.1%三氟乙酸）；43-53min，40%（V/V）乙腈（含0.1%三氟乙酸）；流速为2.0mL/min，检测波长214nm，收集洗脱时间为32-34min的洗脱峰，真空冷冻干燥即得所述ACE抑制肽。所述ACE抑制肽鉴定是通过LC-MS/MS对活性肽进行氨基酸序列鉴定。本专利技术的优点在于：所述牡丹籽粕ACE抑制肽VLSGF具有较强的ACE抑制活性，其IC50值为0.328mg/mL。该ACE抑制肽在细胞水平上无毒副作用，能够提高细胞NO的释放量，且具有分子量小、安全、稳定和容易吸收等特点。该ACE抑制肽可用于制备高血压治疗/预防药物，或作为功能食品添加剂，供高血压患者长期保健使用。附图说明图1：牡丹籽粗蛋白酶解产物SephedexG-25凝胶过滤色谱图。图2：凝胶色谱洗脱组分F4反相高效液相色谱图。图3：ACE抑制肽鉴定的质谱图。图4：ACE抑制肽的活性测定。图5：ACE抑制肽分子对接图。图6：ACE抑制肽细胞毒性结果图。图7：ACE抑制肽对HUVEC细胞ROS水平的影响结果图。图8：ACE抑制肽对HUVEC细胞NO释放量的影响结果图。具体实施方式本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不仅限于下述的实施实例。实施例1本专利技术所述ACE抑制肽的分离纯化包括SephadexG-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两个步骤。牡丹籽粕蛋白酶解产物的制备：牡丹籽粕经粉碎后，经石油醚脱脂干燥后过筛备用。采用碱提酸沉法，加入NaOH溶液从脱脂处理后的牡丹籽粕中提取蛋白，提取工艺条件为：料液比1：25（w/v），浸提pH9.25，提取温度53℃，提取时间70min；将提取液4℃条件下10000r/min离心15min，取上清并调节pH为4.0进行使蛋白酸沉，在4℃条件下10000r/min离心15min后取沉淀，沉淀用水复溶，调节pH为中性，冷冻干燥备用。采用中性蛋白酶将其在最佳酶解条件：底物浓度2%（w/v）、pH7.50、酶添加量7200U/g、温度43℃，酶解2h，酶解后沸水浴10min灭活，经10000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为牡丹籽粕蛋白质酶解产物。SephadexG-25凝胶过滤色谱：将牡丹籽粕蛋白质酶解产物冻干粉，溶解于去离子水中，于4℃下，10000rpm离心10min。取上清液用0.22μm微滤膜过滤除杂后上样。SephadexG-25凝胶柱（1.6cm×100cm）用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱。用去离子水洗脱，流速0.3mL/min，于214nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，如图1所示。收集各组分进行ACE抑制活性测定，以检测ACE抑制肽不同分子量的组分的ACE抑制活性情况。收集洗脱组分F4，真空冷冻干燥，-20℃低温保存备用。高效液相色谱：去离子水溶解上述组分F4干粉，采用高效液相色谱柱Gemini5μC18（250mm×10mm）（Phenomenex，UK）进行进一步分离纯化，用水和乙腈（含0.1%的三氟乙酸）构成的洗脱系统进行梯度洗脱。RP-HPLC的洗脱梯度为0-3min，5%（V/V）乙腈；3-43min，5%-40%（V/V）乙腈；43-53min，40%（V/V）乙腈。流速为2.0mL/min，检测波长214nm，洗脱曲线如图2所示，收集洗脱时间为32-34min的洗脱峰，真空冷冻干燥即得所述抗ACE抑制肽。将收集到的ACE抑制肽组分冷冻干燥，采用高效液相色谱进行二次纯化，检验组分纯度。经检测，该抗氧化肽组分纯度达到95%。用液相色谱与质谱连用（LC-MS/MS）方法测定氨基酸序列（图3），得到该ACE抑制肽的氨基酸序列VLSGF。实施例2对分离纯化获得的ACE抑制肽活性进行活性检测。在96孔板上添加0.1U/mL的ACE酶10μL，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牡丹籽粕ACE抑制肽，其特征在于：所述ACE抑制肽的氨基酸序列为Val-Leu-Ser-Gly-Phe。/n

【技术特征摘要】
1.一种牡丹籽粕ACE抑制肽，其特征在于：所述ACE抑制肽的氨基酸序列为Val-Leu-Ser-Gly-Phe。


2.根据权利要求1所述一种牡丹籽粕ACE抑制肽，其特征在于，所述ACE抑制肽来源于牡丹籽天然提取或人工合成。


3.一种如权利要求1所述的一种牡丹籽粕ACE抑制肽的制备方法，其特征在于：从脱脂后的牡丹籽粕中分离纯化，具体步骤包括如下：
（1）牡丹籽粕蛋白酶解产物的制备：牡丹籽粕经粉碎后，经石油醚脱脂干燥后过筛备用；采用碱提酸沉法得到牡丹籽粕蛋白，然后采用中性蛋白酶将其在以下条件下酶解：底物浓度2%（w/v）、pH7.50、酶添加量7200U/g、温度43℃，酶解时间2h，酶解后沸水浴10min灭活，冷却后调节pH至中性，于4℃条件下1...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪晶，陈秋銮，陈雪芹，孟春，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35