本发明专利技术公开了一种自组装Cu/Zn‑SOD纳米颗粒及其应用，通过单纯Cu/Zn‑SOD的受热自组装，并通过微滤、超滤分离得到的这种纳米颗粒，其比活力高于天然Cu/Zn‑SOD，含有Cu/Zn‑SOD受热变性聚集形成的纳米颗粒载体、以及结合在载体上未变性的Cu/Zn‑SOD分子。本发明专利技术涉及的Cu/Zn‑SOD纳米颗粒的制备与分离过程通过加热、微滤、超滤的方式，不涉及其他任何物质，因此安全性高，是绿色、无污染的纳米颗粒制备方案；分离制备得到的Cu/Zn‑SOD纳米颗粒的抗氧化性优于天然Cu/Zn‑SOD。
【技术实现步骤摘要】
一种自组装Cu/Zn-SOD纳米颗粒及其应用
本专利技术涉及保健食品领域中的蛋白质剂型和制剂技术，具体涉及到一种自组装Cu/Zn-SOD纳米颗粒及其应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）是生物抗氧化剂系统的第一道防线，能够特异性地清除机体内的超氧阴离子自由基。SOD在氧化应激引起的各种疾病的治疗中发挥着重要的作用，如糖尿病及其并发症、炎症性疾病、癌症以及缺血再灌注等。天然的SOD由于半衰期短、分子量大导致不易透过细胞膜、易被酶解失活等缺点，导致其在应用中受到限制。将SOD与纳米技术结合能够改善天然SOD的应用局限性，提高其在机体内的生物利用度，这是由于纳米颗粒具有较大的比表面积、渗透率高以及具有缓释作用的优点。蛋白纳米颗粒的制备主要有四种：超声化学法、乳化法、超临界流体法以及自组装法。目前，研究人员主要将有机溶剂或交联剂与SOD混合，或将SOD与脂质体结合制备纳米SOD。但上述方法大多用到乙醚等有机试剂，对机体不可避免会有轻微毒害作用。此外，上述方法制备纳米SOD的制备工艺较复杂，以及需要制备后纯化的工序。自组装法制备纳米SOD的研究目前较少，大多通过壳聚糖等糖类物质对SOD修饰或逐层自组装。本文采用的纳米颗粒是通过加热使得单纯Cu/Zn-SOD蛋白发生自组装形成纳米颗粒初制品；初制品通过0.45μm的PES滤膜的微滤后，滤液再加入到100KDa超滤膜中，在5000g的条件下超滤离心15min，然后从截留液中得到Cu/Zn-SOD纳米颗粒，其比活力较天然的Cu/Zn-SOD高76.7%。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有比活力高于天然Cu/Zn-SOD分子的Cu/Zn-SOD纳米颗粒及其应用。本专利技术涉及的Cu/Zn-SOD纳米颗粒的制备与分离过程通过加热、微滤、超滤的方式，不涉及其他任何物质；它包括变性的Cu/Zn-SOD聚集形成的纳米载体，以及结合在载体上的活性Cu/Zn-SOD分子，这种结构的Cu/Zn-SOD纳米颗粒未见报道；而且这种纳米颗粒虽然经过加热、超滤等过程，但是其比活力没有降低、反而高于天然SOD。这是基于酶学专业知识预测不到的。另外，这种纳米颗粒是通过特殊的超滤处理才能得到，它的抗氧化性优于天然Cu/Zn-SOD。为实现上述目的，本专利技术可以采用如下技术方案：所述的Cu/Zn-SOD纳米颗粒比活力高于天然Cu/Zn-SOD，含有Cu/Zn-SOD受热变性聚集形成的纳米颗粒载体、以及结合在载体上未变性的Cu/Zn-SOD分子。Cu/Zn-SOD纳米颗粒的制备方法如下：纳米颗粒的初制品的制备方法为取Cu/Zn-SOD粉剂于锥形瓶中，加入蒸馏水使之浓度为1mg/mL，完全溶解后置于60℃水浴预热60min，再置于75℃水浴保温60min，即得到Cu/Zn-SOD纳米颗粒的初制品。所述颗粒粒径范围为141.8—458.7nm，平均粒径为247.3nm；Zeta电位为-19.5mV。初制品通过0.45μm的PES滤膜滤掉其中的絮凝蛋白后，加入到100KDa超滤膜中，在5000g的条件下离心15min，所得截留液即为纯Cu/Zn-SOD纳米颗粒。所得纳米颗粒的比活力为66225.7U/mg，较天然SOD高76.7%。所述颗粒平均粒径为275.2±10.3nm，PdI为0.226，Zeta电位为-9.27±1.53mV。初制品通过0.45μm的PES滤膜滤掉其中的絮凝蛋白后，用SephacrylS-100凝胶过滤柱分离探讨Cu/Zn-SOD纳米颗粒的组成形式，得出Cu/Zn-SOD纳米颗粒由无酶活力的SOD纳米聚集体和有酶活力的SOD分子组成。本专利技术的优点在于：本专利技术涉及的Cu/Zn-SOD纳米颗粒的制备与分离过程通过加热、超滤的方式，不涉及其他任何添加剂或交联剂，因此安全性高，是绿色、无污染的纳米颗粒制备方法；分离制备得到的Cu/Zn-SOD纳米颗粒的抗氧化性优于天然SOD。因此可望用于由氧化应激引起的各种疾病的治疗。附图说明图1Cu/Zn-SOD纳米颗粒及其初制品的粒径分布图。图2Cu/Zn-SOD纳米颗粒初制品在不同pH体系中的酶活力变化图。图3Cu/Zn-SOD纳米颗粒初制品在不同pH体系中的粒径变化图。图4Cu/Zn-SOD纳米颗粒初制品在不同pH体系中的电位变化图。图5Cu/Zn-SOD纳米颗粒初制品的SephacrylS-100凝胶过滤层析图。图6凝胶层析峰值所在样品的粒径分布图。图7Cu/Zn-SOD纳米颗粒及相关样品的全波长扫描图。图8Cu/Zn-SOD纳米颗粒对百草枯刺激的L929细胞存活率的影响（**为各组与空白组相比，p<0.01；#为同浓度间组间的比较，p<0.05；n=4。）。图9Cu/Zn-SOD纳米颗粒初制品对百草枯刺激的L929细胞存活率的影响（*为各组与空白组比较，p<0.05；#为同浓度之间的比较，p<0.05；n=4。）。图10Cu/Zn-SOD纳米颗粒初制品凝胶层析样品对百草枯刺激的L929细胞存活率的影响（*为各组与空白组比较，p<0.05；#为同浓度之间的比较，p<0.05；n=4。）。具体实施方式实施例1：Cu/Zn-SOD纳米颗粒的制备称取Cu/Zn-SOD（以下简称SOD）粉末16mg于锥形瓶中，加入16mL蒸馏水，制备成1mg/mL的SOD溶液，溶解后于60℃水浴预热60min，再置于75℃水浴保温60min，制备得到初制品溶液。用马尔文激光粒度仪测定其粒径和Zeta电位，测得其平均粒径为247.3±1.9nm，聚合物分散性指数（Polymerdispersityindex，PdI）为0.019，Zeta电位为-19.5±0.3。将上述初制品通过0.45μm的PES滤膜滤掉其中的絮凝蛋白后，加入到100KDa超滤膜中，在5000g的条件下离心15min，所得截留液即为Cu/Zn-SOD纳米颗粒。所得纳米颗粒的比活力为66225.7U/mg，较天然SOD高76.7%，平均粒径为275.2±10.3nm，PdI为0.226，Zeta电位为-9.27±1.53mV。Cu/Zn-SOD纳米颗粒及其初制品的粒径分布图见附图1。实施例2：Cu/Zn-SOD纳米颗粒的pH稳定性分别用0.1M的HCl与0.02M的NaOH将Cu/Zn-SOD纳米颗粒初制品的pH调至1-12，静置60min后，过0.45μm滤膜。通过马尔文激光粒度仪测定粒径的变化，再将纳米颗粒溶液pH调至7，用盐酸羟胺法测定酶活。Cu/Zn-SOD纳米颗粒的酶活力变化图见附图2，粒径变化图见附图3，Zeta电位变化见附图4。结果显示Cu/Zn-SOD纳米颗粒在pH4-11的范围内，酶活力没有损失，粒径也无变化，在强酸环境中，酶活力保留率较低，但是仍保持纳米结构，在强碱环境中，酶活力保留率本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种自组装Cu/Zn-SOD纳米颗粒，其特征在于：其是取Cu/Zn-SOD粉剂溶解于蒸馏水中，然后通过加热使得单纯Cu/Zn-SOD蛋白发生自组装形成纳米颗粒；再通过0.45 μm PES滤膜的微滤，得到的滤液再加入到100KDa超滤膜中，在5000 g的条件下超滤离心15 min后，从截留液中得到Cu/Zn-SOD纳米颗粒；所述颗粒平均粒径为275.2±10.3 nm，PdI为0.226，Zeta电位为-9.27±1.53 mV。/n
【技术特征摘要】
1.一种自组装Cu/Zn-SOD纳米颗粒，其特征在于：其是取Cu/Zn-SOD粉剂溶解于蒸馏水中，然后通过加热使得单纯Cu/Zn-SOD蛋白发生自组装形成纳米颗粒；再通过0.45μmPES滤膜的微滤，得到的滤液再加入到100KDa超滤膜中，在5000g的条件下超滤离心15min后，从截留液中得到Cu/Zn-SOD纳米颗粒；所述颗粒平均粒径为275.2±10.3nm，PdI为0.226，Zeta电位为-9.27±1.53mV。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘树滔，何融，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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