检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用。该试剂盒包括作为捕获抗体包被的酶联反应板和酶标抗体的单克隆抗体。所述单克隆抗体重链可变区：CDR1如序列1的第31～36位氨基酸所示；CDR2如序列1的第51～66位氨基酸所示；CDR3如序列1的第99～105位氨基酸所示；轻链可变区：CDR1如序列2的第24～40位氨基酸所示；CDR2如序列2的第56～62位氨基酸所示；CDR3如序列2的第95～103位氨基酸所示。采用狂犬病毒的特异性单克隆抗体制成的酶联免疫定量检测试剂盒，灵敏度高、特异性强，可以有效地区分并检测样品中狂犬病毒糖蛋白抗原的含量。

【技术实现步骤摘要】
检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
本专利技术属于生物检测
，更具体地，本专利技术涉及一种特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫检测试剂盒，适用于狂犬病毒糖蛋白抗原的特异、快速、准确检测。
技术介绍
狂犬病毒是弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)的成员。根据对狂犬病毒N蛋白单克隆抗体以及G蛋白系列的分析和鉴定，全球各地的狂犬病毒主要分成4个血清型。其中血清1型即为人们所熟知的地理分布最广、对世界人民健康威胁最大的狂犬病毒，包括野病毒和固定毒实验室株(如SAD)。随着现代分子生物学的研究进展，参照狂犬病毒核蛋白(Nprotein)基因N端500个核苷酸的相似率，狂犬病毒属被分成7种基因型，基因型2～6只在欧洲和非洲发现。狂犬病毒为不分节段的单股负链RNA病毒，其基因组总长度约1,2000nt，主要编码五种已知的结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA多聚酶(L)。在狂犬病毒感染过程中，人和动物机体既可以产生细胞免疫应答又可以产生体液免疫应答。主要侵害神经细胞、T淋巴细胞为主的淋巴细胞，但对B淋巴细胞影响较小。在此过程中，病毒免疫除了与G蛋白有关外，现在逐步发现与N蛋白和P蛋白也与病毒免疫相关。N基因长度为1350-1353nt，编码N蛋白(Nucleoprotien)，主要负责包装病毒基因组RNA。由于N基因的含量丰富，并且其编码的N蛋白易于被荧光抗体方法检测，所以N基因和N蛋白在抗原诊断及进化分析中应用最广泛的。目前测定狂犬病毒糖蛋白抗原的方法主要免疫荧光法、RT-PCR核酸检测法、病毒分离的方法主要包括细胞培养分离和乳鼠接种法分离，由于以上检测方法都必须在P2或P3实验室中完成，并且上述方法也必须专业的实验人员和设备才能够完成，且耗时较长，根本无法满足大范围的快速诊断需求，因而，需要开发一种操作便捷，特异，灵敏、准确、可靠的狂犬病毒糖蛋白抗原检测方法。目前，酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA)是市场上主流的免疫测定技术，已广泛应用于临床检测，快速便捷且灵敏度高，且不需要特殊的仪器设备。伴随着单克隆抗体技术的发展，各种病原的抗原检测方法得到了前所未有的发展，由于单克隆抗体是针对抗原上单一表位筛选制备的抗体，因此能够敏感特异地识别狂犬病毒糖蛋白抗原，为基于单克隆抗体技术的狂犬病毒糖蛋白抗原检测方法奠定了基础，目前还未检索到有关狂犬病抗原定量检测的酶联免疫吸附试验的检测方法，因此本专利技术具有独创性和新颖性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒，该试剂盒利用一株可以与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体RV1作为捕获抗体及检测抗体，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的狂犬病毒糖蛋白抗原检测方法，用于检测疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液和破乳后的成品疫苗等中的狂犬病毒糖蛋白抗原含量。基于上述目的，本专利技术的特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原酶联免疫试剂盒，包括以捕获抗体包被的酶联反应板和酶标检测抗体。所述酶标检测抗体优选为经辣根化物酶标记抗体，所述辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在检测抗体上。捕获抗体和检测抗体均为与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体RV1。所述捕获抗体和检测抗体(与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体RV1)均为含有重链可变区RV1-VH和轻链可变区RV1-VL；所述RV1-VH和RV1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述RV1-VH和所述RV1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述RV1-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第31～36位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第51～66位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第99～105位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第24～40位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第56～62位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第95～103位氨基酸所示；优选的，所述RV1-VH的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1的第1～116位所示；其RV1-VL的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2的第1～113位所示；所述酶联反应板的最佳包被制备方法及条件是将所述狂犬病毒的一株特异性单克隆抗体RV1用pH9.6的碳酸盐溶液稀释成0.5～10μg/ml(优选0.5-4ug/ml，更优选1-4ug/ml，最后选1ug/ml)的包被工作液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，100μl/孔，2～8℃下放置8～12小时，使特异性单克隆抗体RV1与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。优选的，所述试剂盒还包括抗原标准品，所述抗原标准品为狂犬病毒糖蛋白抗原，纯度不低于80％，抗原含量为4IU，使用时用样品稀释液稀释至(6.2mIU～200mIU)，所测OD450nm值用于绘制标准曲线。本专利技术试剂盒是采用狂犬病毒特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，通过检测酶催化底物产生的信号变化来定量检测样品中狂犬病毒的抗原含量。更进一步的，所述试剂盒还包括样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液。所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板。所述样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。本专利技术还要求保护单克隆抗体，其可与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合，是下述单克隆抗体：1)含有重链可变区RV1-VH和轻链可变区RV1-VL；所述RV1-VH和RV1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述RV1-VH和所述RV1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述RV1-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第31～36位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第51～66位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第99～105位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第24～40位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒，包括捕获抗体包被的酶联反应板和酶标记检测抗体；所述与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体含有重链可变区RV1-V

【技术特征摘要】
1.一种特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒，包括捕获抗体包被的酶联反应板和酶标记检测抗体；所述与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体含有重链可变区RV1-VH和轻链可变区RV1-VL；所述RV1-VH和RV1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述RV1-VH和所述RV1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述RV1-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第31～36位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第51～66位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第99～105位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第24～40位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第56～62位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第95～103位氨基酸所示。


2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述RV1-VH的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1的第1～116位所示；其RV1-VL的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2的第1～113位所示。


3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括抗原标准品，所述抗原标准品为狂犬病毒糖蛋白抗原。


4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将所述捕获抗体溶于pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng～1000ng捕获抗体，2～8℃下放置8～12小时，使捕获抗体与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。


5.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液；所述底物...

【专利技术属性】
技术研发人员：董春娜，张蕾，宋芳，肖进，齐鹏，李静，李鹏宇，刘新月，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11