一株耐高温植物乳杆菌及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种制备融合菌株的方法，其为以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为亲本菌株，通过灭活的双亲原生质体融合，并针对产酸、抑菌和耐高温性进行筛选，获得融合菌株。实验证明，本发明专利技术制备融合菌株的方法可制备得到能够产酸，又兼具芽孢菌的产酶和抗逆性、耐高温性的融合菌株。以本发明专利技术的方法制备得到的植物乳杆菌SG‑03，乳酸产量较高，且具有较好的抑菌活性，能耐高温，有较好的可加工性，对人、畜安全，没有环境污染问题，培养条件简单，容易保存适合开发应用，以其所制备的活菌剂产品可以促进肉鸡生长，提高肉鸡的产能。

【技术实现步骤摘要】
一株耐高温植物乳杆菌及其制备方法
本专利技术涉及生物
中一株植物乳杆菌及其制备方法。
技术介绍
近年来，抗生素在人和动物中的普遍使用甚至是滥用所带来的弊端日益彰显。长期使用抗生素会使人和动物肠道内的正常菌群失调，影响机体免疫功能的形成，甚至因长期滥用抗生素产生了具有多重抗药性的“超级细菌”。因此，寻找抗生素的替代品成为人类未来生存和发展的紧迫任务。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是目前已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌。植物乳杆菌对肠黏膜具有很强的黏附能力和优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人体肠道中定植并繁殖，可改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患肠道疾病；植物乳杆菌能够产生一种被称为“植物乳杆菌素”的多肽类广谱抗菌物质，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，有助于其在动物胃肠道内的定植。植物乳杆菌作为益生菌制剂可显著增加肠黏膜IgA的含量，提高机体免疫力从而维护肠道生态平衡，促进动物健康。植物乳杆菌作为国际上公认的新型益生乳酸菌，具有很高的理论研究和生产应用价值。但是，植物乳杆菌不能形成具有强抗逆性的休眠体，如芽孢，温度耐受性较差，这也大大限制了其在饲料加工中的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何制备能够产酸，又兼具芽孢菌的产酶和抗逆性、耐高温性的植物乳杆菌。为解决上述技术问题，本专利技术的一个目的是提供一株植物乳杆菌，所述植物乳杆菌是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SG-03，其在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为GDMCCNo：61035。该菌株已于2020年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大楼59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编510070。下文简称植物乳杆菌SG-03。植物乳杆菌SG-03菌体形状为短杆状，菌体平均大小为0.9-1.2μm×4.0-9.0μm，革兰氏染色为阳性，不产芽孢，无鞭毛，但能运动，无荧光特性。植物乳杆菌SG-03在MRS培养基上菌落呈乳白色，粘稠，表面光滑，平板上常显示为不透明的圆形凸起。能够发酵戊糖或葡萄糖酸盐，产酸不产气。通常不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。植物乳杆菌SG-03的生长温度范围在15-45℃，最适宜生长温度为30-35℃，生长pH值在3.5-8.5，最适宜pH值为4.5-6.5。植物乳杆菌SG-03具有序列表中序列1所示的16SrDNA。本专利技术的另一个目的是提供制备上述植物乳杆菌的方法，其为以植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)为亲本菌株，通过灭活的双亲原生质体融合，并针对产酸、抑菌和耐高温性进行筛选，获得融合菌株。本专利技术制备融合菌株的方法，具体包含如下步骤：S1、培养植物乳杆菌获得植物乳杆菌菌悬液，将植物乳杆菌菌悬液酶解破壁得到植物乳杆菌原生质体悬液，灭活植物乳杆菌原生质体悬液得到灭活的植物乳杆菌原生质体悬液；培养地衣芽孢杆菌获得地衣芽孢杆菌悬液，将地衣芽孢杆菌悬液酶解破壁得到地衣芽孢杆菌原生质体悬液，灭活地衣芽孢杆菌原生质体悬液得到灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液；S2、以聚乙二醇(PEG)配制促融剂，将灭活的植物乳杆菌原生质体悬液和灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液融合、再生，获得融合子；S3、按照能够产生乳酸，能够代谢酪蛋白，具备抑制部分革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的能力，同时能够耐高温的标准筛选融合子，获得融合菌株。上述方法中，所述植物乳杆菌菌悬液酶解破壁采用溶菌酶和蜗牛酶。上述方法中，所述灭活植物乳杆菌原生质体悬液可为60℃热灭活15min。上述方法中，所述地衣芽孢杆菌悬液酶解破壁采用溶菌酶和溶壁酶。上述方法中，所述灭活地衣芽孢杆菌原生质体悬液采用功率为30W的紫外照射120s。上述方法中，所述灭活的植物乳杆菌原生质体悬液，灭活前植物乳杆菌原生质体浓度达到2.0×107个/mL；所述灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液，灭活前地衣芽孢杆菌原生质体浓度达到1.1×108个/mL。上述方法中，所述促融剂的配制方法如下：向SMM高渗溶液中加入聚乙二醇(PEG-6000)，使其质量百分含量为40％，得到促融剂；所述SMM高渗溶液的配制方法如下：向蒸馏水中加入蔗糖、MgCl2·6H2O和顺丁烯二酸，使它们的含量分别为蔗糖0.5mol/L、MgCl2·6H2O0.02mol/L、顺丁烯二酸0.02mol/L，调整pH值为7.0，121℃灭菌22min，得到SMM高渗溶液，4℃保存备用。上述方法中，所述植物乳杆菌可为植物乳杆菌CICC20265；所述地衣芽孢杆菌可为地衣芽孢杆菌CICC10092。原生质体融合是一项十分有用的育种技术，与其他育种技术相比具有以下优点：(1)能克服有性杂交的不亲和性,冲破种属的界限，而达到种间、属间乃至界间的融合，实现远缘杂交；(2)重组频率高、受结合型或致育型限制小，以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制；(3)避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求比基因工程简单，投资少；(4)去除了细胞壁的阻碍，两亲株融合后整套基因组相互接触，从而构建集双亲优良遗传性状于一体的融合子。植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌都是对动物肠道健康有益的益生菌，将此两种菌进行融合，可实现融合子既具备了地衣芽孢杆菌较强的产蛋白酶、产淀粉酶能力以及形成芽孢可耐高温的能力，也具有了乳酸菌耐受胃部的低酸环境以及肠道前段高胆盐环境的能力，肠道定殖能力大大增强，同时还能够克服其不易培养和制剂化的缺陷，融合子在厌氧和有氧环境中都能很好生长，并具有高抗逆性的能力。开展植物乳杆菌与地衣芽孢杆菌的融合选育研究，以获得兼具两亲本菌株优良性状的融合菌株，实现一菌多效，是获得乳酸菌和芽孢菌优势互补的一个全新课题，具有极高的现实意义与应用价值。本专利技术的植物乳杆菌原生质体悬液和地衣芽孢杆菌原生质体在融合前通过紫外或加热方式灭活，主要是为了便于后续融合子的筛选。原生质体融合目的是将双亲的遗传物质进行转化和互补，从而获得兼具双亲优良性状的新菌株，而灭活的亲本可大大减少后续融合子筛选的干扰，同时又能定向筛选双亲互补的“真实”融合子。根据亲本菌株植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌的生理特点，经热灭活的植物乳杆菌原生质体与经紫外灭活的地衣芽孢杆菌生质体进行融合，在双亲原生质体融合过程中，两个菌株的遗传物质发生了不同程度的变化，某些遗传物质在基因重组后在融合株中表达出来，使得两个亲本菌株能够在一定程度上的实现互补，达到融合子筛选的目的。实验证明，本专利技术制备融合菌株的方法可制备得到能够产酸，又兼具芽孢菌的产酶和抗逆性、耐高温性的融合菌株。以本专利技术的方法制备得到的植物乳杆菌SG-03，乳酸产量较高，且具有较好的抑菌活性，能耐高温，有较好的可加工性，对人、畜安全，没有环境污染问题，培养条件简单，容易保存适合开发应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，其菌株号为SG-03，其在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为GDMCCNo：61035。/n

【技术特征摘要】
1.植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，其菌株号为SG-03，其在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为GDMCCNo：61035。


2.权利要求1所述的植物乳杆菌的制备方法，其特征在于：其为以植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌为亲本菌株，通过灭活的双亲原生质体融合，得到权利要求1所述的植物乳杆菌。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：包含如下步骤：
S1、培养植物乳杆菌获得植物乳杆菌菌悬液，将植物乳杆菌菌悬液酶解破壁得到植物乳杆菌原生质体悬液，灭活植物乳杆菌原生质体悬液得到灭活的植物乳杆菌原生质体悬液；培养地衣芽孢杆菌获得地衣芽孢杆菌悬液，将地衣芽孢杆菌悬液酶解破壁得到地衣芽孢杆菌原生质体悬液，灭活地衣芽孢杆菌原生质体悬液得到灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液；
S2、以聚乙二醇配制促融剂，将灭活的植物乳杆菌原生质体悬液和灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液融合、再生，获得融合子；
S3、按照能够产生乳酸，能够代谢酪蛋白，具备抑制部分革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的能力，同时能够耐高温的标准筛选融合子，获得融合菌株。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述植物乳杆菌菌悬液酶解破壁采用溶菌酶和蜗牛酶。


5.根据权利要求3或4所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军超，黄钦耿，梁玲，翁雪清，吴松刚，
申请(专利权)人：松刚福建生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35