猪胰蛋白酶变体制造技术

本发明专利技术涉及猪胰蛋白酶的多肽变体、编码这些变体的核酸分子以及包含此类核酸分子的宿主细胞。本发明专利技术还涉及这些变体在用于产生胰岛素的方法中的用途。本发明专利技术还涉及这些变体作为药剂、作为食品成分或作为饲料成分的用途以及这些变体在制造食品成分或饲料成分的工艺内的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】猪胰蛋白酶变体
本专利技术涉及猪胰蛋白酶的多肽变体、编码这些变体的核酸分子以及包含此类核酸分子的宿主细胞。本专利技术还涉及这些变体在用于产生胰岛素的方法中的用途。本专利技术还涉及这些变体作为药剂、作为食品成分或作为饲料成分的用途以及这些变体在制造食品成分或饲料成分的工艺内的用途。
技术介绍
内肽酶胰蛋白酶用于制造人胰岛素、胰岛素类似物，并且还用于胰岛素衍生物。使用胰蛋白酶通过酶水解由前胰岛素原(PPI)产生人胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物，其中切掉前序列和C肽以便产生相应的产物(参见图1)。胰蛋白酶特异性地在多肽链内的Arg和Lys残基的C末端侧处切割。在人前胰岛素原和甘精前胰岛素原多肽内，在B链和C肽的接点处存在若干Arg和Lys残基，包括B29Lys、B31Arg和B32Arg。因此，在Arg和Lys残基的C末端侧处(包括在B29Lys和B31Arg和B32Arg的C末端侧处)通过胰蛋白酶切割人前胰岛素原和甘精前胰岛素原。对于甘精胰岛素的制造，B32Arg之后进行的胰蛋白酶切割提供最终的甘精胰岛素。B29Lys和B31Arg之后进行的胰岛素酶切割产生副产物desB30-Thr(“des-Thr”)-甘精胰岛素和desB32Arg-甘精胰岛素(也被称为“des-Arg”)。因此，需要去除甘精胰岛素的制造工艺中的副产物。对于人胰岛素的制造，B31Arg之后进行的胰蛋白酶切割产生B31Arg-人胰岛素(也被称为“mono-Arg”)，并且B32Arg之后进行的胰蛋白酶切割产生B31Arg-B32Arg-人胰岛素(也被称为“di-Arg”)。两者在所述制造工艺中均是中间体。在后续制造工艺中，这两种中间体均转化为最终的人胰岛素。B29Lys之后进行的胰岛素酶切割产生副产物desB30-Thr(“des-Thr”)-人胰岛素。因此，需要去除人胰岛素的制造工艺中的副产物。对于人胰岛素和甘精胰岛素的制造，B32Arg之后进行的胰蛋白酶切割产生最终的甘精胰岛素，并且对于人胰岛素的制造，其产生中间体，所述中间体在后续工艺步骤中转化为最终的人胰岛素。为了解决不合需要的desB30-Thr中间体形成的问题，过去的发展产生了猪胰蛋白酶变体S172A，其通过增加针对Arg相对于Lys的C末端侧的选择性来减少此错切割。猪胰蛋白酶变体S172A描述在国际专利申请WO2007/031187A1中，将其通过引用以其整体特此并入。现在，在诸位专利技术人仔细观察胰蛋白酶S172A催化反应的动力学时，他们意外地发现错切割的副产物的形成不仅是由于通过充当内切蛋白酶的胰岛素酶进行的PPI的初级错切割(如文献中所述)，还由于充当外肽酶的猪胰蛋白酶以及其变体S172A所固有的副活性。外肽酶活性还导致在形成des-Arg和des-Thr时甘精胰岛素的降解。本专利技术背后的技术问题因此，现有技术需要具有降低的副活性，尤其是具有降低的外肽酶活性的新型胰蛋白酶变体。此类新型胰蛋白酶变体将减少PPI切割中的副产物的量，并且在由PPI产生胰岛素(或胰岛素衍生物)时将产生更高产率的胰岛素和胰岛素衍生物。诸位专利技术人制备了新型猪胰蛋白酶变体，其具有降低的外肽酶活性和/或在PPI切割反应中显示减少的副产物形成。以上综述不一定描述了本专利技术解决的所有问题。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及一种猪胰蛋白酶变体，其包含与SEQIDNO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列与SEQIDNO:1相比不同之处至少在于在对应于根据SEQIDNO:1的天然猪胰蛋白酶的F24、S44、D56、G78、Y131、S172和W193的一个或多个位置处的一个或多个氨基酸取代，前提是所述氨基酸序列不是根据SEQIDNO:1的天然猪胰蛋白酶；并且前提是所述氨基酸序列不是根据SEQIDNO:2的猪变体胰蛋白酶S172A。在第二方面，本专利技术涉及一种核酸分子，其编码根据第一方面的猪胰蛋白酶变体。在第三方面，本专利技术涉及一种宿主细胞，其含有根据第二方面的核酸分子。在第四方面，本专利技术涉及一种产生根据第一方面的猪胰蛋白酶变体的方法，其包括以下步骤：培养根据第三方面的宿主细胞，以及从培养基或从所述宿主细胞分离所述猪胰蛋白酶变体。在第五方面，本专利技术涉及根据第一方面的猪胰蛋白酶变体或根据第二方面的核酸分子或根据第三方面的宿主细胞，其用作药剂；用作食品成分；用作饲料成分或用于在制造食品成分或饲料成分的工艺内使用。在第六方面，本专利技术涉及根据第一方面的猪胰蛋白酶变体在用于产生人胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物的方法中的用途。在第七方面，本专利技术涉及根据第一方面的猪胰蛋白酶变体用于切割具有通式A-Lys-Thr-Arg-Arg-B的蛋白质或肽的用途，其中A是由一个或多个氨基酸组成的氨基酸序列；并且其中B是由一个或多个氨基酸组成的氨基酸序列。在第八方面，本专利技术涉及一种组合物，其包含根据第一方面的猪胰蛋白酶变体或根据第二方面的核酸分子或根据第三方面的宿主细胞。附图说明图1示出了人胰岛素和甘精胰岛素的前胰岛素原的主要胰蛋白酶切割位点的示意图。实心三角形代表产生一种或多种产物的切割位点，空心三角形代表产生副产物的切割位点。未显示前胰岛素原的二硫键。图2示出了用胰蛋白酶变体S172A(SEQIDNO:2)进行的甘精前胰岛素原的切割。所述图示出了甘精胰岛素的形成以及最主要的切割副产物B31Arg-甘精胰岛素(甘精胰岛素B链的位置31之后的切割，在图中缩写为“des-Arg”)和desB30Thr甘精胰岛素(甘精胰岛素B链的位置29之后的切割，在图中缩写为“des-Thr”)的形成的时间依赖性过程。图3示出了用胰蛋白酶变体S172A(SEQIDNO:2)进行的甘精胰岛素的切割，作为胰蛋白酶变体S172A的外肽酶活性的例子。所述图示出了甘精胰岛素的时间依赖性降低以及主要产物B32-desArg-甘精胰岛素(甘精胰岛素B链的位置31之后的切割，在图中缩写为“des-Arg”)和少量副产物B30-desThr甘精胰岛素(甘精胰岛素B链的位置29之后的切割，在图中缩写为“des-Thr”)的形成。图4示出了用胰蛋白酶变体105号(SEQIDNO:105)进行的甘精前胰岛素原的切割，作为用经优化的胰蛋白酶变体进行的切割的例子。所述图示出了甘精胰岛素的形成以及最主要的切割副产物B31Arg-甘精胰岛素(甘精胰岛素B链的位置31之后的切割，在图中缩写为“des-Arg”)和desB30Thr甘精胰岛素(甘精胰岛素B链的位置29之后的切割，在图中缩写为“des-Thr”)的形成减少的时间依赖性过程。具体实施方式定义虽然下文详细描述了本专利技术，但是应理解，本专利技术不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些方法、方案和试剂可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本专利技术的范围，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪胰蛋白酶变体，其包含/n与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，/n其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比不同之处至少在于在对应于根据SEQ ID NO:1的天然猪胰蛋白酶的F24、S44、D56、G78、Y131、S172和W193的一个或多个位置处的一个或多个氨基酸取代，/n前提是所述氨基酸序列不是根据SEQ ID NO:1的天然猪胰蛋白酶；并且/n前提是所述氨基酸序列不是根据SEQ ID NO:2的猪变体胰蛋白酶S172A。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180222 EP 18158034.11.一种猪胰蛋白酶变体，其包含
与SEQIDNO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，
其中所述氨基酸序列与SEQIDNO:1相比不同之处至少在于在对应于根据SEQIDNO:1的天然猪胰蛋白酶的F24、S44、D56、G78、Y131、S172和W193的一个或多个位置处的一个或多个氨基酸取代，
前提是所述氨基酸序列不是根据SEQIDNO:1的天然猪胰蛋白酶；并且
前提是所述氨基酸序列不是根据SEQIDNO:2的猪变体胰蛋白酶S172A。


2.根据权利要求1所述的猪胰蛋白酶变体，
其中对应于F24的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Ala、Asn、Arg、Gln、Ile、Leu、Lys、Met、Ser、Thr和Val；
其中对应于S44的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Leu和Pro；
其中对应于D56的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Ala、Asn、His和Trp；
其中对应于G78的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Ala、Glu、Pro、Ser和Tyr；
其中对应于Y131的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Val；
其中对应于S172的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Ala、Cys和Thr；并且/或者
其中对应于W193的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Phe、Ser、Thr和Tyr。


3.根据权利要求1至2中任一项所述的猪胰蛋白酶变体，其中所述氨基酸序列与SEQIDNO:1相比另外的不同之处至少在于在对应于根据SEQIDNO:1的天然猪胰蛋白酶的R99、R107、K125和K170的一个或多个位置处的一个或多个氨基酸取代。


4.根据权利要求3所述的猪胰蛋白酶变体，
其中对应于R99的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Ala、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Leu、Phe、Thr、Trp和Tyr；
其中对应于R107的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Asp、Gly、Pro、Ser和Thr；
其中对应于K125的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Ala、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Ser和Tyr；并且/或者
其中对应于K170的位置处的氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Ala、Asn、Gly和Tyr。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的猪胰蛋白酶变体，其中所述氨基酸序列是SEQIDNO:3，
其中
-Xaa24是选自以下的氨基酸：Ala、Asn、Arg、Gln、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr和Val；
-Xaa44是选自以下的氨基酸：Leu、Pro和Ser；
-Xaa56是选自以下的氨基酸：Ala、Asn、Asp、His和Trp；
-Xaa78是选自以下的氨基酸：Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Tyr；
-Xaa99是选自以下的氨基酸：Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Leu、Phe、Thr、Trp和Tyr；
-Xaa107是选自以下的氨基酸：Arg、Asp、Gly、Pro、Ser和Thr；
-Xaa125是选自以下的氨基酸：Ala、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Ser和Tyr；
-Xaa131是选自以下的氨基酸：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val；
-Xaa170是选自以下的氨基酸：Ala、Asn、Gly、Lys和Tyr；
-Xaa172是选自以下的氨基酸：Ala、Cys、Ser和Thr；并且/或者
-Xaa193是选自以下的氨基酸：Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr；
前提是SEQIDNO:3不是根据SEQIDNO:1的猪野生型胰蛋白酶；并且
前提是SEQIDNO:3不是根据SEQIDNO:2的猪变体胰蛋白酶S172A。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的猪胰蛋白酶变体，其中所述氨基酸序列选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·施蒂尔格，S·里瑟姆，C·费勒，A·沃格尔，
申请(专利权)人：赛诺菲安万特德国有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE