用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法及多层多相纳米颗粒技术

本发明专利技术涉及蛋白质制备和透皮递送领域，公开了一种用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法及多层多相纳米颗粒。该方法包括在不含动物源性成分的发酵培养基中发酵细菌肉毒杆菌，并使发酵培养基与阴离子交换培养基浆料接触，并经离心获得包含肉毒杆菌神经毒素的上清液。该方法还包括透析上清液并收集包含肉毒杆菌神经毒素的经透析溶液，使经透析溶液与阴离子交换色谱柱接触，使从阴离子交换色谱柱收集的洗脱液与阳离子交换色谱柱接触，并收集洗脱液。纳米颗粒包括最里层的水相核或油相核、水相层、油相层和最外层的乳膏层。水相层和油相层交替地包封，形成多层多相纳米细胞粒。生物分子包括肉毒杆菌神经毒素和/或透明质酸等活性分子。

【技术实现步骤摘要】
用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法及多层多相纳米颗粒
本专利技术涉及蛋白质制备和透皮递送领域，更具体地，涉及肉毒杆菌神经毒素A的制备和纳米包封的包含肉毒杆菌神经毒素A的生物分子和其他大分子量生物分子的透皮递送。
技术介绍
肉毒杆菌毒素是细菌肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)产生的神经毒素，所述肉毒杆菌是一种革兰氏阳性产芽胞厌氧杆状菌，通常存在于植物、土壤、水和动物肠道中。根据肉毒杆菌抗原性的不同可区分为七种(A、B、C、D、E、F和G)。所有血清型均通过阻断神经肌肉接合处的主要神经递质乙酰胆碱的释放，麻痹肌肉来干扰神经传递。如今，肉毒杆菌神经毒素在多种治疗应用中发挥着重要作用，包括斜视、局灶性肌张力障碍、半面痉挛、各种痉挛性运动障碍、头痛、多涎和多汗症，并且其应用范围仍在迅速扩大。肉毒杆菌神经毒素也常用于美容美体应用，包括矫正整个面部、下巴、颈部和胸部的纹路、褶皱和皱纹，以及其他皮肤病学应用，例如多汗症和多痘症。2002年，美国食品和药物管理局(FDA)批准(保妥适，肉毒杆菌神经毒素A是其有效成分)用于美容美本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1）在发酵培养基中发酵细菌肉毒杆菌，其中所述发酵培养基不含动物源性成分；/n2）使包含所述细菌肉毒杆菌的所述发酵培养基与阴离子交换培养基浆料接触，并经离心获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的上清液；/n3）透析所述上清液并收集包含所述肉毒杆菌神经毒素的经透析溶液；/n4）使包含所述肉毒杆菌神经毒素的所述经透析溶液与阴离子交换色谱柱接触；/n5）重复步骤3）和步骤4）并获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的洗脱液，并使从所述阴离子交换色谱柱获得的所述洗脱液与阳离子交换色谱柱接触；/n6）收集包含从所述阳离子交换色谱柱获得的所述...

【技术特征摘要】
20190522 US 16/419,5081.一种用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）在发酵培养基中发酵细菌肉毒杆菌，其中所述发酵培养基不含动物源性成分；
2）使包含所述细菌肉毒杆菌的所述发酵培养基与阴离子交换培养基浆料接触，并经离心获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的上清液；
3）透析所述上清液并收集包含所述肉毒杆菌神经毒素的经透析溶液；
4）使包含所述肉毒杆菌神经毒素的所述经透析溶液与阴离子交换色谱柱接触；
5）重复步骤3）和步骤4）并获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的洗脱液，并使从所述阴离子交换色谱柱获得的所述洗脱液与阳离子交换色谱柱接触；
6）收集包含从所述阳离子交换色谱柱获得的所述肉毒杆菌神经毒素的洗脱液。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述不含动物源性成分的发酵培养基包含植物蛋白胨。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述不含动物源性成分的发酵培养基还包含右旋糖、酵母提取物和自溶酵母泥中的至少一种。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述植物蛋白胨由大豆、马铃薯或大米中的至少一种获得。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中，使包含细菌肉毒杆菌的发酵培养基在收获时添加酸形成酸泥进行沉淀。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）与步骤3）之间还包括：
重复使包含所述细菌肉毒杆菌的所述发酵培养基与所述阴离子交换培养基浆料接触的步骤，并经离心获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的上清液；和
合并所述包含使发酵培养基与阴离子交换介质浆料反复接触获得的肉毒杆菌神经毒素的上清液。


7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5）还包括：
在使所述包含从阴离子交换色谱柱获得的肉毒杆菌神经毒素的洗脱液与所述阳离子交换色谱柱接触之前，透析所述包含从阴离子交换色谱柱获得的肉毒杆菌神经毒素的洗脱液。


8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述肉毒杆菌神经毒素是肉毒杆菌神经毒素A。


9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
使用小鼠LD50测定，所述肉毒杆菌神经毒素A的生物比活性为100至400单位/纳克。


10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6）之后还包括：
将所述包含从阳离子交换色谱柱获得的肉毒杆菌神经毒素的洗脱液与包含乙二醇、甘油和丙二醇中的稳定剂混合。


11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：
所述稳定剂包括乙二醇、甘油和丙二醇，并且
以总体积重量计，所述稳定剂在添加至洗脱液后的浓度范围为10~-30(w/v)%。


12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述稳定剂中：
所述乙二醇添加至洗脱液后的浓度范围为5~20(w/v)%，
所述甘油添加至洗脱液后的浓度范围为1~10(w/v)%，
所述丙二醇添加至洗脱液后的浓度范围为1~5(w/v)%。


13.一种多层多相纳米颗粒，其特征在于：包括：
最里层的水相核或油相核；
多个水相层；
多个油相层；和
最外层的乳膏层，其中：
多个水相层中的每一水相层和多个油相层中的每一油相层交替包封水相核或油相核，形成水相、油相相间的多层多相纳米颗粒；
所述水相核、水相层中包含有生物分子，所述生物分子包括肉毒杆菌神经毒素和/或透明质酸；
所述油相核、油相层中包含有油溶性分子。


14.根据权利要求13所述的多层多相纳米颗粒，其特征在于：
所述肉毒杆菌神经毒素的制备方法包括以下步骤：
1）在发酵培养基中发酵细菌肉毒杆菌，其中所述发酵培养基不含动物源性成分，
2）使所述包含细菌肉毒杆菌的发酵培养基与阴离子交换培养基浆料接触，并经离心获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伯科，
申请(专利权)人：杭州美依生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33