一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法，涉及脐血干细胞技术领域，为解决现有的脐血干细胞储存性能不够完善，储存性能容易影响后期干细胞的活性以及治疗性能的问题。步骤1、脐血干细胞提取；步骤2、进行脐血单个核细胞的分离，将收集到的体积＞60mL并且具有MNCs计数的脐血分到50mL离心管中，体积设置为20mL，采用MACS法分离脐血MNCs；步骤3、脐血干细胞的储存，将样品放入程控降温机中，按设定好的降温速度控速降温，降温速度设置为1‑2℃/min，当样品的温度降至40℃时，改为10℃/min，到‑80℃后直接投入液氮中保存；步骤4、注射前准备；步骤5、进行干细胞注射；步骤6、注射后注意事项。

【技术实现步骤摘要】
一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法
本专利技术涉及脐血干细胞
，具体为一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法。
技术介绍
脐带血是指胎儿娩出，将脐带结扎并离断后，残留在胎盘和脐带中的血液。脐带血中含有大量的干细胞，包括造血干细胞和多种其他干细胞，统称为脐带血干细胞。脐带血造血干细胞已经有30多年拯救生命的历史。目前还有多项脐带血在再生医学方面的临床研究，目的是利用脐带血干细胞促进机体组织和器官的损伤修复，为了方便存储和临床应用，脐带血经过分离制备的过程尽可能的去除红细胞及血浆，其有核细胞成分被富集起来。富集的细胞里即含有多种干细胞，具有自我更新能力及分化为多种成熟细胞的潜能；同时还含有大量的免疫细胞，具有很好的免疫调节和抗感染作用。但是，现有的脐血干细胞储存性能不够完善，储存性能容易影响后期干细胞的活性以及治疗性能；因此不满足现有的需求，对此我们提出了一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的现有的脐血干细胞储存性能不够完善，储存性能容易影响后期干细胞的活性以及治疗性能问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法，包括以下步骤：步骤1、脐血干细胞提取，取得产妇知情同意后，按照脐血标本采集标准，选择采用一次性无菌塑料采血袋，在新生儿娩出后，立即在距脐5-7cm处结扎脐带并剪断，消毒脐带行脐静脉穿刺，使血液因重力作用流入含有ACD保养液的采血袋中，轻摇血袋，以防凝血，采血完毕立即将采血袋打结封口，整个过程均严格无菌操作完成；步骤2、进行脐血单个核细胞的分离，将收集到的体积＞60mL并且具有MNCs计数的脐血分到50mL离心管中，体积设置为20mL，采用MACS法分离脐血MNCs，全过程均在超净工作台无菌操作完成；步骤3、脐血干细胞的储存，将样品放入程控降温机中，按设定好的降温速度控速降温，降温速度设置为1-2℃/min，当样品的温度降至40℃时，改为10℃/min，到-80℃后直接投入液氮中保存；步骤4、注射前准备，抽取患者外周血，提取少量残存免疫调节细胞，体外经过实验室提纯、分离、纯化，将免疫调节细胞大量扩增，激活其效应，然后将基因导入该细胞，再回输到患者体内，当天抽取当天进行回输；步骤5、进行干细胞注射，干细胞疗法旨在借助靶向注射技术，将干细胞准确注射至卵巢局部，修复重建受损的卵巢细胞，促血管生长，构建卵巢微环境，刺激卵泡生长，促进排卵，促进雌孕激素的正常分泌，从而缓解各种因激素分泌不足导致的临床症状；步骤6、注射后注意事项，当患者体温超过38.5℃，临床科室应及时通知生物免疫治疗中心实验室，当天暂停回输细胞，细胞制剂从实验室取出后，为了保持细胞的活性，需要冷藏保存并应及时回输。优选的，所述步骤2中的MACS法流程为用PBS稀释抗凝脐带血细胞，加在淋巴细胞分离液上，2000-2500r·min-1离心30min，吸取中间白膜层，缓冲液PBS洗涤1次，1500r·min-1离心10min，弃上清，洗涤3次，每108总细胞在350μL缓冲液中重悬，加人100μLFcR阻断剂及50μLCD34抗体标记细胞，混匀，4-8℃标记10min，1500r·min-1离心10min，去上清，洗涤1次，每108总细胞加入100μL抗生物素微珠，混匀，4-8℃孵育15min，加人缓冲液洗涤细胞，1500r·min-1离心10min完全去除上清，通过MACS磁性分离柱，获取CD34+细胞。优选的，所述步骤3中在液氮中储存标本分为两种方式，一种是利用液氮蒸汽储存，温度范围为-100-194℃，另一种是储存于液氮196℃中，常用二甲亚砜(DMSO)和羟乙基淀粉(HES)作为冻存保护剂，采用两步降温法进行程序降温保存外周血干细胞：以1℃/min分钟的速率从4℃降温至-45℃，然后以5℃/min的速率从-45℃降温至-110℃，转入液氮中保存复苏后细肥存活率在81.4％-94.8％之间，CFU-GM回收率为66.1％，程控降温、液殒保存的降温速率由电脑精密控制，保证了细胞在冻存过程中不会因为降温达度波动引起细胞不稳定，降低了降温对细胞的损伤。优选的，所述步骤5中干细胞注射前需要体外培养ERC细胞，经过实验室提纯、分离、纯化和扩增后，在B超引导下经阴道后穹窿穿刺后直接注射到卵巢局部，细胞基因靶向利用自体细胞，把一个或多个基因负载到细胞上，使细胞向卵巢免疫调节细胞转化的能力大大增强，通过在体外经过实验室提纯、分离、纯化，将免疫调节细胞大量扩增，激活其效应，然后将修饰基因导入该细胞，修复卵巢受损细胞，提高患者整体免疫机能，基因靶向可准确识别病灶受损细胞，精准定向到卵巢病灶部位，进而稳定持久的表达靶向性基因，修复重建受损卵巢细胞，构建卵巢新生微环境，刺激卵泡生长，促进排卵，治疗前卵巢萎缩、卵泡干瘪，治疗后卵泡饱满、活力增强，治疗后卵泡饱满鲜嫩、重现青春活力，针对生育后卵巢早衰患者可有效改善诸如皮肤松弛、皱纹及常夜无眠等症状，并具有高效修复基因、抗氧化、提升肌肤光泽及增强机体免疫力、提升私密生活质量等显著功效。优选的，所述步骤6中的注意事项还包括：两周内应注意清淡饮食，避免食用过敏性食物，治疗后可能会出现注射部位局部轻微的红肿及体温升高，同时也可能会出现慵懒或者疲乏的现象，活性细胞正通过自身免疫系统的识别效益，尽量减少或者最好停止吸烟，至少在一个月内不饮烈酒，10天内不宜进行网球、游泳等剧烈体育运动，一周内不宜进行桑拿、汗蒸等保健活动，治疗后一个月内不可接受疫苗注射，避免造成不良反应，应注意休息，避免剧烈运动，同时注意增加机体免疫营养、保障健康的生活方式及良好的心情状态，使细胞发挥最佳的作用，维持更长的时间。优选的，所述步骤1中采血袋的采集量设置为65-120ml。优选的，所述步骤6中冷藏保存并应及时回输的时间设置为6h以内。优选的，所述步骤2中标本在采集3h内进行分离。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术通过在步骤2中进行脐血干细胞的分离，采用MACS法分离脐血MNCs，MACS法所得MNCs经半固体琼脂培养后能获得更多CFU-GM集落数，表明该法能阻止MNCs的沉降，利于从脐血中富集更多的HSCs，能够更好的保障后期干细胞注射后的全面性能，能够更好的发挥作用；2、本专利技术通过在步骤3中设置储存降温速度，能够在保障干细胞后期最大活性的同时把储存的伤害降到最低，液殒保存的降温速率由电脑精密控制，保证了细胞在冻存过程中不会因为降温达度波动引起细胞不稳定，降低了降温对细胞的损伤，解决了现有的脐血干细胞储存性能不够完善，储存性能容易影响后期干细胞的活性以及治疗性能的问题。具体实施方式本专利技术提供的一种实施例：一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法，包括以下步骤：步骤1、脐血干细胞提取，取得产妇知情同意后，按照脐血标本采集标准，选择采用一次性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1、脐血干细胞提取，取得产妇知情同意后，按照脐血标本采集标准，选择采用一次性无菌塑料采血袋，在新生儿娩出后，立即在距脐5-7cm处结扎脐带并剪断，消毒脐带行脐静脉穿刺，使血液因重力作用流入含有ACD保养液的采血袋中，轻摇血袋，以防凝血，采血完毕立即将采血袋打结封口，整个过程均严格无菌操作完成；/n步骤2、进行脐血单个核细胞的分离，将收集到的体积＞60mL并且具有MNCs计数的脐血分到50mL离心管中，体积设置为20mL，采用MACS法分离脐血MNCs，全过程均在超净工作台无菌操作完成；/n步骤3、脐血干细胞的储存，将样品放入程控降温机中，按设定好的降温速度控速降温，降温速度设置为1-2℃/min，当样品的温度降至40℃时，改为10℃/min，到-80℃后直接投入液氮中保存；/n步骤4、注射前准备，抽取患者外周血，提取少量残存免疫调节细胞，体外经过实验室提纯、分离、纯化，将免疫调节细胞大量扩增，激活其效应，然后将基因导入该细胞，再回输到患者体内，当天抽取当天进行回输；/n步骤5、进行干细胞注射，干细胞疗法旨在借助靶向注射技术，将干细胞准确注射至卵巢局部，修复重建受损的卵巢细胞，促血管生长，构建卵巢微环境，刺激卵泡生长，促进排卵，促进雌孕激素的正常分泌，从而缓解各种因激素分泌不足导致的临床症状；/n步骤6、注射后注意事项，当患者体温超过38.5℃，临床科室应及时通知生物免疫治疗中心实验室，当天暂停回输细胞，细胞制剂从实验室取出后，为了保持细胞的活性，需要冷藏保存并应及时回输。/n...

【技术特征摘要】
1.一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、脐血干细胞提取，取得产妇知情同意后，按照脐血标本采集标准，选择采用一次性无菌塑料采血袋，在新生儿娩出后，立即在距脐5-7cm处结扎脐带并剪断，消毒脐带行脐静脉穿刺，使血液因重力作用流入含有ACD保养液的采血袋中，轻摇血袋，以防凝血，采血完毕立即将采血袋打结封口，整个过程均严格无菌操作完成；
步骤2、进行脐血单个核细胞的分离，将收集到的体积＞60mL并且具有MNCs计数的脐血分到50mL离心管中，体积设置为20mL，采用MACS法分离脐血MNCs，全过程均在超净工作台无菌操作完成；
步骤3、脐血干细胞的储存，将样品放入程控降温机中，按设定好的降温速度控速降温，降温速度设置为1-2℃/min，当样品的温度降至40℃时，改为10℃/min，到-80℃后直接投入液氮中保存；
步骤4、注射前准备，抽取患者外周血，提取少量残存免疫调节细胞，体外经过实验室提纯、分离、纯化，将免疫调节细胞大量扩增，激活其效应，然后将基因导入该细胞，再回输到患者体内，当天抽取当天进行回输；
步骤5、进行干细胞注射，干细胞疗法旨在借助靶向注射技术，将干细胞准确注射至卵巢局部，修复重建受损的卵巢细胞，促血管生长，构建卵巢微环境，刺激卵泡生长，促进排卵，促进雌孕激素的正常分泌，从而缓解各种因激素分泌不足导致的临床症状；
步骤6、注射后注意事项，当患者体温超过38.5℃，临床科室应及时通知生物免疫治疗中心实验室，当天暂停回输细胞，细胞制剂从实验室取出后，为了保持细胞的活性，需要冷藏保存并应及时回输。


2.根据权利要求1所述的一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法，其特征在于：所述步骤2中的MACS法流程为用PBS稀释抗凝脐带血细胞，加在淋巴细胞分离液上，2000-2500r·min-1离心30min，吸取中间白膜层，缓冲液PBS洗涤1次，1500r·min-1离心10min，弃上清，洗涤3次，每108总细胞在350μL缓冲液中重悬，加人100μLFcR阻断剂及50μLCD34抗体标记细胞，混匀，4-8℃标记10min，1500r·min-1离心10min，去上清，洗涤1次，每108总细胞加入100μL抗生物素微珠，混匀，4-8℃孵育15min，加人缓冲液洗涤细胞，1500r·min-1离心10min完全去除上清，通过MACS磁性分离柱，获取CD34+细胞。


3.根据权利要求1所述的一种采用脐血干细胞输注延缓卵巢早衰的方法，其特征在于：所述步骤3中在液氮中储存标本分为两种方式，一种是利用液氮蒸汽储存，温度范围为-100-194℃，另一种是储存于液氮196℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵江涛，花育旗，陈斌，
申请(专利权)人：江苏中衍生科细胞技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32