一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法技术

本发明专利技术公开一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，涉及细胞提取领域。该用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，包括：脐带间充质干细胞分离制备和鉴定、脐带间充质干细胞培养上清液获取和脐带间充质干细胞提取物的分离纯化。该用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，采用贴壁细胞专业细胞培养瓶，能让细胞增殖速度稳定，提高收集上清液的效率，低氧环境中培养，模拟干细胞体内环境，刺激大量的细胞因子分泌，细胞的反复冻融，使得细胞破碎，同样可以分泌出大量的细胞因子，样本来源单一，采用ELISA方法测定蛋白浓度，保证批次产品的均一性，有利于产品后续的应用。续的应用。续的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞提取
，具体为一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞是来源于发育期早期中胚层和外胚成的一类多能干细胞。具有免疫调控、能够修复损伤或病变的组织器官、具备多向分化潜能等功能，因此具有广泛的应用前景。
[0003]干细胞抗衰老基于其两种基本功能，一是干细胞的增殖分化能力，可以分化成不同的体细胞以代替衰老死亡的机体细胞，二是干细胞的旁分泌功能，可以产生许多生物活性分子，间充质干细胞一个强大的功能就是分泌众多的营养性细胞因子。越来越多的研究表明，间充质干细胞旁分泌作用在其发挥治疗效果中起主要作用。
[0004]目前市面上添加到化妆品中的成分多为干细胞培养上清液，该上清液分泌因子含量低、均一性差、稳定性差，美容效果一般，且提取上清液的效率低下，因为提出了一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术公开了一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，包括：脐带间充质干细胞分离制备和鉴定、脐带间充质干细胞培养上清液获取和脐带间充质干细胞提取物的分离纯化。
[0009]优选的，所述脐带间充质干细胞分离制备和鉴定包括以下步骤：
[0010]S1：取健康足月的新生脐带15
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30cm，置于含保存液的无菌储存容器中，待分离制备；
[0011]S2：将脐带置于培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端结扎部分去除；再反复洗涤脐带组织，直至血液全部洗净；将脐带剪成3
‑
5cm长度小段；将脐带剖开，去除血管，撕取华通氏胶；用生理盐水充分洗涤华通氏胶，后将其剪碎成约1mm3大小组织块；
[0012]S3：将组织块接种于T75的培养瓶中，每T75培养瓶中添加10ml无血清培养基，放置于37℃，5％的CO2培养箱中培养，培养第5d后，去除旧培养基，添加新的无血清培养基；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出；培养第10d后，去除旧培养基，添加新的无血清培养基。第13天细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁的细胞消化转移至新的T175培养瓶中传代培养；
[0013]S4：使用表面标志物的方法对细胞进行鉴定。
[0014]优选的，所述保存液为100ml的DMEM；无血清培养基为10％的血清替代物，其余为无酚红干细胞培养基。
[0015]优选的，所述脐带间充质干细胞培养上清液获取包括以下的步骤：
[0016]S1：将检测合格的细胞按5
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104/ml的溶度转至T175培养瓶，做好标记，置37℃，5％的CO2培养箱中进行扩增培养；
[0017]S2：当扩增培养的细胞融合度达到60％时，调整培养箱参数37℃，5％的CO2，5％的O2继续培养，24小时后以上收集细胞上清液，并将细胞收集；
[0018]S3：用每10ml盐水重悬5000万细胞数。将细胞悬液放置零下80℃的超低温冰箱，反复冻融2
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3次。离心去掉死细胞，将1：49添加到细胞上清液中。
[0019]优选的，所述脐带间充质干细胞提取物的分离纯化包括以下的步骤：
[0020]S1：将收集的间充质干细胞培养上清液放入离心管中，4℃，2000g离心10分钟，取上清，去除细胞沉渣；
[0021]S2：将去除沉渣的上清液转至5KD超滤浓缩离心管中，4℃，4000g离心2h，收集浓缩液得到干细胞提取物，调节总蛋白浓度至1mg/ml。
[0022]本专利技术公开了一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，其具备的有益效果如下：
[0023]1、该用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，采用了无血清、无酚红培养体系培养人脐带间充质干细胞，避免了酚红对皮肤的刺激，特别是过敏皮肤，安全性更有保证，适合各种人群使用，采用贴壁细胞专业细胞培养瓶，能让细胞增殖速度稳定，提高收集上清液的效率，低氧环境中培养，模拟干细胞体内环境，刺激大量的细胞因子分泌，细胞的反复冻融，使得细胞破碎，同样可以分泌出大量的细胞因子，样本来源单一，采用ELISA方法测定蛋白浓度，保证批次产品的均一性，有利于产品后续的应用。
[0024]2、该用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，使得细胞破碎，可以分泌出大量的细胞因子，如白介素(IL
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6)：免疫调节；肿瘤坏死因子
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α(TNF
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α)：减退黑色素；血管内皮生长因子(VEGF):诱导血管生成；转化生长因子
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β(TGF
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β)：促进细胞增殖，分化，修复；血小板源性生长因子(PDGF):诱导胶原蛋白生成；肝细胞生长因子(THGF)：修复疤痕；碱性成纤维细胞生长因子(b
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FGF)：促进细胞增殖与血管生成；角质细胞生长因子(KGF)：刺激毛囊再生；胰岛素生长因子(IGF)：促进细胞分化与增殖；纤连蛋白：激活细胞；I型胶原蛋白：保湿、美白、防皱、祛斑等，间充质干细胞所分泌的因子具有改善细胞生长微环境、调节机体免疫、促进血管再生、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等功能，融抗皱、美白、抗氧化、淡化痘印、促进毛发再生等多重功效于一体，通过焕活衰老的细胞来达到肌肤、毛发再生的功效。
附图说明
[0025]图1为本专利技术流程示意图。
具体实施方式
[0026]本专利技术实施例公开一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，
[0027]请参照附图1，包括：脐带间充质干细胞分离制备和鉴定、脐带间充质干细胞培养
上清液获取和脐带间充质干细胞提取物的分离纯化。
[0028]脐带间充质干细胞分离制备和鉴定包括以下步骤：
[0029]S1：取健康足月的新生脐带15
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30cm，置于含保存液的无菌储存容器中，待分离制备；
[0030]S2：将脐带置于培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端结扎部分去除；再反复洗涤脐带组织，直至血液全部洗净；将脐带剪成3
‑
5cm长度小段；将脐带剖开，去除血管，撕取华通氏胶；用生理盐水充分洗涤华通氏胶，后将其剪碎成约1mm3大小组织块；
[0031]S3：将组织块接种于T75的培养瓶中，每T75培养瓶中添加10ml无血清培养基，放置于37℃，5％的CO2培养箱中培养，培养第5d后，去除旧培养基，添加新的无血清培养基；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出；培养第10d后，去除旧培养基，添加新的无血清培养基。第13天细胞数量较多，去除组织本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括：脐带间充质干细胞分离制备和鉴定、脐带间充质干细胞培养上清液获取和脐带间充质干细胞提取物的分离纯化。2.根据权利要求1所述的一种用于化妆品脐带间充质干细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述脐带间充质干细胞分离制备和鉴定包括以下步骤：S1：取健康足月的新生脐带15
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30cm，置于含保存液的无菌储存容器中，待分离制备；S2：将脐带置于培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端结扎部分去除；再反复洗涤脐带组织，直至血液全部洗净；将脐带剪成3
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5cm长度小段；将脐带剖开，去除血管，撕取华通氏胶；用生理盐水充分洗涤华通氏胶，后将其剪碎成约1mm3大小组织块；S3：将组织块接种于T75的培养瓶中，每T75培养瓶中添加10ml无血清培养基，放置于37℃，5％的CO2培养箱中培养，培养第5d后，去除旧培养基，添加新的无血清培养基；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出；培养第10d后，去除旧培养基，添加新的无血清培养基。第13天细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁的细胞消化转移至新的T175培养瓶中传代培养；S4：使用表面标志物的方法对细胞进行鉴定。3.根据权利要求2所述的一种用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵江涛，花育旗，陈斌，沈传磊，
申请(专利权)人：江苏中衍生科细胞技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：