靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备制造技术

靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备，它属于CRISPR基因治疗领域。方法：制备靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的质粒；构建Minicircle‑CRISPR/Cas9的真核表达载体；制备基因转染材料；制备复合纳米粒。本发明专利技术中将表达质粒高效转染到细胞中，特异性的诱导相应病毒阳性细胞的致癌元件移码突变，失去致癌特性，甚至直接导致细胞凋亡，达到降低病毒负荷、清除病毒及病变细胞、逆转癌变的目的，具有重要的临床应用价值。对SiHa细胞的杀伤力强，能有效抑制SiHa异位移植瘤的生长；本发明专利技术方法简单，成本低。本发明专利技术适用于敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因。

【技术实现步骤摘要】
靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备
本专利技术属于CRISPR基因治疗领域，具体涉及靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备。
技术介绍
病毒感染是危害人类健康的主要威胁之一，与人类密切相关的有呼吸道病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒等。目前应对病毒感染的方法主要依赖疫苗防御和药物治疗。但即使是最先进的疫苗也无法完全覆盖不同种族人群的全部感染型别。同时，很大一部分已经存在感染的人群无法接受疫苗的接种；而不断突变的病毒致病基因也给预防性疫苗的应用带来了挑战。此外，部分病毒疫苗价格昂贵，在中国及其他发展中国家推行全民疫苗接种，在经济、依从性和效果上均难以保障。最重要的一点是，很多病毒性感染疾病目前尚无有效的治疗性抗体或药物，导致已经存在感染的人群既无法接受疫苗的接种，亦无药物来彻底清除，只能定期筛查随访。长期反复的筛查给广大患者带来了严重的心理压力及经济负担，部分人群甚至失访。在此背景下，随着全基因组测序技术的成熟和基因功能的研究，通过基因编辑进行抗病毒治疗成为可能并有良好趋势。人乳头瘤病毒(Huma本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备，其特征在于它按以下步骤实现：/n一、制备靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的质粒：/na、利用CRISPR Design在线sgRNA设计工具，针对人乳头瘤病毒16型的URR基因，设计其sgRNA序列；所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示；/nb、利用CRISPR Design在线sgRNA设计工具，针对疱疹病毒的LMPI基因，设计其sgRNA序列；所述sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示；/n二、构建Minicircle-CRISPR/Cas9的真核表达载体：/nc、将人乳头瘤病毒16型的URR基因的sgRNA...

【技术特征摘要】
1.靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备，其特征在于它按以下步骤实现：
一、制备靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的质粒：
a、利用CRISPRDesign在线sgRNA设计工具，针对人乳头瘤病毒16型的URR基因，设计其sgRNA序列；所述sgRNA序列如SEQIDNO.1所示；
b、利用CRISPRDesign在线sgRNA设计工具，针对疱疹病毒的LMPI基因，设计其sgRNA序列；所述sgRNA序列如SEQIDNO.2所示；
二、构建Minicircle-CRISPR/Cas9的真核表达载体：
c、将人乳头瘤病毒16型的URR基因的sgRNA序列和Cas9序列克隆到真核表达载体PX330-Minicircle上，产物经鉴定后挑选出正确的克隆进行扩增并提取质粒，获得靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的质粒；
d、将疱疹病毒的LMPI基因的sgRNA序列和Cas9序列克隆到真核表达载体PX330-Minicircle上，产物经鉴定后挑选出正确的克隆进行扩增并提取质粒，获得靶向敲除疱疹病毒关键基因的质粒；
三、制备基因转染材料：
f、合成带有双键末端的中间产物；
g、利用步骤f中产物合成带氨基末端的中间产物；
h、利用步骤g中产物合成带羧基末端的中间产物；
i、利用步骤h中产物合成壳聚糖接枝聚-β-氨基酯，其结构通式为，所述结构通式中m为10～30，壳聚糖部分的分子量为2～50w；
四、复合纳米粒的制备：将壳聚糖接枝聚-β-氨基酯超声溶解于溶剂中，然后加入靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的质粒或靶向敲除疱疹病毒关键基因的质粒，涡旋振荡混匀后室温孵育30min，即完成靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备。


2.根据权利要求1所述的靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备，其特征在于步骤三中所述制备基因转染材料的具体操作如下：
f、合成带有双键末端的中间产物：分别称取0.1mol5-氨基-1-戊醇以及0.1mol1,4-丁二醇二丙烯酸酯，加1mLDMF，90℃搅拌反应24h；停止反应，用10mLDMF稀释反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢红娴，
申请(专利权)人：珠海舒桐医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44