MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法技术

一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，先用含血清培养基贴壁培养MDCK细胞，再经消化后，将所得细胞悬液置入摇瓶悬浮培养，传代3～4次后，将培养液离心，并使用化学限定培养基重悬细胞团，继续悬浮培养，传代至MDCK细胞完全单个悬浮生长。本发明专利技术的驯化方法，相较于逐步降血清法更快速高效，驯化时间仅需10代左右，远高于逐步降血清方法。相较于一步驯化法更温和，不受驯化所用无血清培养基的品质限制，更具有普遍应用价值，且其所用驯化时间同样较短，与一步驯化法相当。

【技术实现步骤摘要】
MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法
本专利技术涉及一种用于生产生物制品的方法，尤其涉及一种驯化细胞的方法，以使其是适应悬浮培养。
技术介绍
近年来，全球季节性流感疫苗的市场需求正在逐年稳步上升，众多发展中国家疫苗接种率较低的事实更是体现了季节性流感疫苗的巨大潜在市场开发前景。此外自2009年后岁无大流行流感的爆发，流感病毒依然对人类社会存在威胁。相较于传统的鸡胚生产法，用动物细胞来生产流感疫苗正在逐步成为主流生产方式。在过去十几年中，使用贴壁MDCK细胞来扩增流感病毒已取得了巨大的进展，然而该培养模式仍存在诸多的弊端，如：血清的使用会因换液导致培养工艺的复杂性以及血清批次引起的工艺稳定性问题。此外，高细胞密度培养通常受到微载体的表面积的限制，而MDCK细胞的在无血清或化学限定培养基中悬浮培养则可以解决以上弊端，使生产工艺操作简单、控制稳定、简化下游纯化操作，更易实现流感疫苗的大规模生产。在化学限定培养基中培养MDCK细胞因培养基成分明确、外源DNA含量控制而更适宜用于人用流感疫苗的生产。获得可悬浮培养的MDCK细胞系需要进行MDCK贴壁细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，包括如下步骤：/n先将于含血清培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80％～90％时，弃去含血清培养基，润洗后加入胰酶溶液消化5分钟～10分钟；待细胞变圆后，轻轻拍打容器底部使MDCK细胞解离，加入含血清培养基终止消化；/n接着将收集到的MDCK细胞悬液转移至摇瓶中，加入含血清培养基并将细胞密度调整至0.8～1.5×10

【技术特征摘要】
1.一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，包括如下步骤：
先将于含血清培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80％～90％时，弃去含血清培养基，润洗后加入胰酶溶液消化5分钟～10分钟；待细胞变圆后，轻轻拍打容器底部使MDCK细胞解离，加入含血清培养基终止消化；
接着将收集到的MDCK细胞悬液转移至摇瓶中，加入含血清培养基并将细胞密度调整至0.8～1.5×106个细胞/mL，悬浮培养，将摇床转速设定为100rpm，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5％；
然后，用含血清培养基对MDCK细胞进行3～4次传代，每次传代后细胞密度需保持在0.8～1.5×106个细胞/mL；
之后，将含MDCK细胞的培养液进行离心并弃上清液，加入化学限定培养基重悬细胞团，继续悬浮培养，并传代至MDCK细胞完全单个悬浮生长，获得在化学限定培养基中悬浮培养的MDCK细胞系，摇床转速设定为130rpm，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5％。


2.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的含血清培养基，以DMEM为基础培养基，并添加10％胎牛血清。


3.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的终止消化的含血清培养基，以DMEM为基础培养基，并添加了10％胎牛血清，添加量为1-2mL。


4.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的MDCK细胞在含血清培养基中的传代培养应以轻微聚团形式悬浮生长，每隔48小时传代一次。


5.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的对MDCK细胞进行1000rpm离心10分钟，在化学限定培养中传代培养至少传6代后可呈现单个悬浮生长。


6.根据权利要求1所述的MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，其特征在于所述的化学限定培养基，各组分及其含量包括：
基础代谢营养物，包括：
4000～10000mg/LD-葡萄糖；50～600mg/L丙酮酸钠；5～30mg/LL-丙氨酸；180～600mg/LL-精氨酸；5～60mg/LL-天冬酰胺；5～60mg/LL-天冬氨酸；5～80mg/LL-胱氨酸；10～150mg/LL-半胱氨酸；5～60mg/LL-谷氨酸；300～1500mg/LL-谷氨酰胺；5～100mg/L甘氨酸；5～150mg/LL-组氨酸；10～150mg/LL-异亮氨酸；40～250mg/LL-亮氨酸；40～150mg/LL-赖氨酸；10～150mg/LL-甲硫氨酸；10～250mg/LL-苯丙氨酸；10～200mg/LL-脯氨酸；40～150mg/LL-丝氨酸；40～200mg/LL-苏氨酸；10～100mg/LL-色氨酸；10～100mg/LL-酪氨酸；40～200mg/LL-缬氨酸；
核苷酸，包括：
5～25mg/L次黄嘌呤；0.1～2mg/L胸苷；1～15mg/L腺苷；1～15mg/L尿苷；1～15mg/L胞苷；1～15mg/L鸟苷；
维生素，包括：
0.01～0.20mg/LD-生物素；2～10mg/L叶酸；2～10mg/L烟酰胺；2～10mg/L吡哆醇；2～10mg/L硫胺素；0.1～1mg/L核黄素；10～50mg/L氯化胆碱；2～10mg/LD-泛酸钙；10～50mg/L肌醇；
无机盐，包括：
10～50mg/L硝酸铁；0.1～1mg/L硫酸亚铁；200～500mg/L氯化钾；6000～9000mg/L氯化钠；50～100mg/L磷酸氢二钠；50～100mg/L磷酸二氢钠；...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱绍荣，张成林，
申请(专利权)人：上海荣盛生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31