基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，所述检测试剂盒采用二代测序探针捕获技术，所述检测试剂盒的试剂包括质控品、建库试剂和RNA探针；所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为阴性样本溶于TE中，所述阳性质控品为含有MSI位点的质粒溶于TE中；在MSI的实验方法上选用了NGS技术，其优势在于检测位点多——筛选后覆盖多达40个微卫星位点，对微卫星覆盖区域广泛，RNA探针调整后均一性良好，可对患者有较好的用药指导，适用于多肿瘤如结直肠癌、子宫内膜癌、胃肠道肿瘤等。

【技术实现步骤摘要】
基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒
本专利技术涉及检测试剂盒
，特指基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒。
技术介绍
微卫星(Microsatellite)是指通常以1-6bp为一个重复单元，重复次数≤60次的短串联重复序列。微卫星位点散落于各条染色体上，为易发生突变区域，呈现高度多态性，具体表现为不同个体间或正常组织与肿瘤组织之间，微卫星位点重复单元(1-6bp)的重复次数具有波动性。基于微卫星位点的分布广泛性及高度多态性,微卫星常被用于肿瘤发生机制的研究。微卫星不稳定(MicrosatelliteInstability,MSI)是指DNA复制过程中的“链滑”错误且未被DNA错配修复系统(MMR)修复，而引起的微卫星区域重复序列插入或缺失现象，也即重复单元重复次数具有差异性。根据差异性的程度，MSI分为MSI-H(MicroSatelliteInstabilityHigh),MSI-L(MicroSatelliteInstaillityLow)以及MSS(MicroSatelliteStable)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒采用二代测序探针捕获技术，所述检测试剂盒的试剂包括质控品、建库试剂和RNA探针；/n所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为阴性样本溶于TE中，所述阳性质控品为含有MSI位点的质粒溶于TE中；/n所述建库试剂包括末端修复&加A 试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂和扩增试剂；/n所述RNA探针为识别相关MSI位点的RNA单链探针，所述RNA探针的片段长度在90-120nt之间，且修饰有生物素，所述RNA探针与DNA文库片段进行杂交，捕获链霉亲和素特异性的识别生物素、特异性的洗脱和富...

【技术特征摘要】
1.基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒采用二代测序探针捕获技术，所述检测试剂盒的试剂包括质控品、建库试剂和RNA探针；
所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为阴性样本溶于TE中，所述阳性质控品为含有MSI位点的质粒溶于TE中；
所述建库试剂包括末端修复&加A试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂和扩增试剂；
所述RNA探针为识别相关MSI位点的RNA单链探针，所述RNA探针的片段长度在90-120nt之间，且修饰有生物素，所述RNA探针与DNA文库片段进行杂交，捕获链霉亲和素特异性的识别生物素、特异性的洗脱和富集程序，得到最终所需的DNA片段。


2.根据权利要求1所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒的使用方法，具体步骤为：
S1：利用超声波进行物理打断DNA；
S2：进行末端修复和加A654尾反应，取用S1中的反应液50ul与末端修复&加A尾反应液15ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀30分钟后加热到65℃反应30分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液A；
S3：进行加接头反应，取用S2中的65ul反应液A、加接头缓冲液25ul、加接头酶5ul和接头5ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀15分钟后加热到70℃反应10分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液B；
S4：进行第一步纯化反应，获得反应液C；
S5：进行文库扩增反应；取用S4中的15ul反应液C、扩增混合液25ul和通用引物10ul进行轻微吹打混匀，获得反应液D；
S6：进行第二步纯化反应，获得反应液E；
S7：进行杂交反应，获得反应液F；
S8：进行捕获反应，获得反应液G；
S9：进行PCR富集反应，获得反应液H；
S10：进行第三步纯化反应，获得反应液J；
S11：质控品数据分析。


3.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S1利用超声波进行物理打断DNA具体操作为：检测开始前30分钟启动CovarisM220仪器，检查Covaris槽装满AFA-gradewater（新鲜去离子水）至刚好淹过槽口，且覆盖管的玻璃部分，设置温度在4℃之间，以保证读到的水浴温度为4℃；根据microTUBE类型（50μL和130μL）和目标片段（200~300bp），预先设置打断程序；将250ng的高质量白细胞gDNA加到microTUBE管，使用无核酶水稀释至总体积为55μL，盖上管盖使用预设程序进行基因组打断。


4.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S4进行第一步纯化反应，获得反应液C的具体步骤为：
S41:纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀;
S42:取80ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:0.8）加入至加接头的溶液中，vortex30s，室温孵育10min;
S43:配置新鲜的75%乙醇;
S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，将上清液倒出；
S45:加300ul75%乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S46:离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S47:加水18ul洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，继续下步操作。

【专利技术属性】
技术研发人员：方小云，
申请(专利权)人：俊兮生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31