抗CD33嵌合抗原受体及其用途制造技术

本发明专利技术的实施方案提供了对CD33具有抗原特异性的嵌合抗原受体(CAR)。公开了与CAR相关的核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群和药物组合物。还公开了检测哺乳动物中癌症的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物的癌症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗CD33嵌合抗原受体及其用途相关申请的交叉引用本专利申请要求于2018年3月14日提交的美国临时专利申请第62/643,015号的权益，将其通过引用整体并入本文。关于联邦赞助的研发的声明本专利技术是由国立卫生研究院国家癌症研究所在项目号ZIABC011565的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。通过引用并入电子提交的材料通过引用整体并入本文的是同时提交并通过如下识别的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名为“741580_ST25.txt”的一个69,707个字节的ASCII(文本)文件，日期为2019年3月14日。专利技术背景急性髓细胞白血病是高度侵袭性的急性白血病，代表发生在儿童，青少年和青年(AYA)中的第二常见的白血病。尽管当前的治疗方案包括强化的多药化疗周期，和通常通过同种异体供体干细胞移植巩固以实现治愈，但只有60％的患有AML的儿童和AYA可以实现长期缓解。需要新的治疗策略来提高缓解率，减少复发并改善总体生存率。
技术实现思路
本专利技术的实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含对CD33具有特异性的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域。本专利技术的另一个实施方案提供了包含本文所述氨基酸序列的CAR构建体。本专利技术的其它实施方案提供与本专利技术的CAR构建体相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群以及药物组合物。本专利技术的另外的实施方案提供检测哺乳动物中癌症的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物的癌症的方法。r>附图的简要说明图1A和1B示出了本专利技术的某些CAR实施方案的图。Mylo：吉妥单抗，靶向人CD33的人源化抗体hP67.6。M195：靶向人CD33的人源化单克隆鼠IgG2a抗体(M195)，其来自用活人白血病成髓细胞免疫的小鼠。Hu195：靶向人CD33的人源化抗体。图2A-2F示出了显示CAR的转导效率的图。图3A和3B示出了显示白血病细胞上CD33和CD123靶抗原表达(指示为萦光强度)的流式细胞术分析的图。图4A-4F示出了显示体外刺激后CD33和CD123CART细胞产生的细胞因子的图。如图所示，将CD33或CD123CAR转导的T细胞与靶白血病细胞一起孵育。通过ELISA检测上清液中的干扰素γ或IL-2水平。图5A-5C示出了显示IncuCyte杀伤测定的图。如图所示，将CD33CAR转导的T细胞与靶白血病细胞一起孵育。绘制了活白血病细胞相对于原始接种细胞的差异。图5D和5E示出了IncuCyte杀伤测定的图。如图所示，将CD123CAR转导的T细胞与靶白血病细胞一起孵育。将活白血病细胞的差异相对于只有肿瘤的对照归一化。5D：MOLM14细胞的杀伤。5E：THP1细胞的杀伤。图6A-6E示出了生物发光图像，其用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展，如图所示。抗CD19CAR对CD33抗原是非特异性的。图7A显示了用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展的生物发光图像。在第-7天将1百万个PDX白血病细胞JMM117注射到NSG小鼠中。在第7天用CART细胞处理小鼠。图7B和7C是显示在第二周的脾脏中的(图7B)人AMLJMML117细胞和(图7C)CD33CART细胞的图。两幅图的数字如在图7B的图例中所示。图8是显示白血病细胞上CD33靶抗原表达(指示为萦光强度)的流式细胞术分析的图。缩写如实施例2中所述。图9A和9B是柱状图，其显示了在体外刺激后CD33Hu195-CD28ZCART细胞产生的细胞因子。如图所示，将CD33Hu195-CD28ZCAR-转导的T细胞与靶白血病细胞孵育16小时。通过ELISA检测上清液中的干扰素γ或IL-2水平。图10示出了生物发光图像，其用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展，如图所示。在第-7天将一百万个MOLM14白血病细胞注射到NSG小鼠中。7天后，将小鼠用生理盐水处理，未处理或用CART细胞处理(图像列上方列出的细胞数)。较暗的区域代表更大的肿瘤负担。“数值范围(scale)”涉及萦光强度，其基于显示的数值范围(如果将范围置于较低的值，则萦光强度看起来会非常高，但是如果将范围置于较高的值，则强度看起来会变暗)。图11A和11B：CD33Hu195-CD28z临床载体的验证。图11A：用生物素化的人Siglec-3进行的CD33CAR表达检测。图11B：生物发光图像，其用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展。在第0天将一百万个白血病细胞MOLM14注射到NSG小鼠中。在第3天用5E6个CART细胞处理小鼠。图12A-12C：CAR共刺激结构域对细胞代谢的影响。将CD33.2-28z和CD33.2-BBzCART细胞与MOML14共孵育，并在7天后用Seahorse机器测试其代谢特征。图12A(顶部曲线为5天-CD33.2-28，底部曲线为5天-CD33.2-BB)：在第7天，CD33.2-28z和CC33.2-BBzCART细胞在基础代谢条件下并响应线粒体抑制剂的耗氧率(OCR)。图12B(左为CD33.2-28，右为CD33.2-BB)：基础OCR水平vs最大呼吸水平。图12C(左为CD33.2-28，右为CD33.2-BB)：质子泄漏相关的OCR和ATP产生相关的OCR。图12D-124F：CAR共刺激结构域对细胞能量表型的影响。将CD33.2-28z和CD33.2-BBzCART细胞与MOML14共孵育，并在7天后使用Seahorse机器测试其细胞能量表型，(图12D，左曲线为CD33.2-28，右曲线为CD33.2-BB)细胞能量表型。(图12E，左为CD33.2-28，右为CD33.2-BB)耗氧率。(图12F，左为CD33.2-28，右为CD33.2-BB)胞外酸化速率。图13示出了生物发光图像，其用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展，如图所示。较暗的区域代表更大的肿瘤负担。专利技术的详细描述急性骨髓性白血病(AML)是一种侵袭性恶性肿瘤，当该疾病变得细胞毒性化疗难以治疗时，通常使用强化的细胞毒性化疗方案和有限的替代治疗选择来治疗。CAR为人工构建的杂合蛋白或多肽，所述杂合蛋白或多肽含有连接至T细胞信号传导结构域的一种或多种抗体的抗原结合结构域(如，单链可变片段(scFv))。CAR的特性包括它们能够利用单克隆抗体的抗原结合性质，以非-MHC-限制的方式重定向T细胞对选定的靶标的特异性和反应性。非-MHC限制的抗原识别使表达CAR的T细胞能够不依赖抗原加工而识别抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。本文使用的短语“抗原特异性”和“引起抗原特异性应答”是指CAR可以特异性结合抗原并在免疫学上识别抗原，使得CAR与抗原的结合引起免疫应答。CD33在绝大多数AML原始细胞和原始细胞危象中的慢性骨髓性白血病的表面表达。它还在T细胞急性成淋巴细胞性白血病的子集中异常表达。正常组织的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.嵌合抗原受体(CAR)，其包含对CD33具有抗原特异性的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域，其中/n(a)所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含Hu195的CDR1、CDR2和CDR3区；或/n(b)所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含Hu195的CDR1、CDR2和CDR3区，/n其中所述CDR区是SEQ ID NOS：41-46中的CDR区。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180314 US 62/643,0151.嵌合抗原受体(CAR)，其包含对CD33具有抗原特异性的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域，其中
(a)所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含Hu195的CDR1、CDR2和CDR3区；或
(b)所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含Hu195的CDR1、CDR2和CDR3区，
其中所述CDR区是SEQIDNOS：41-46中的CDR区。


2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQIDNO：15的重链可变区。


3.根据权利要求1或2所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQIDNO：16的轻链可变区。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQIDNO：4的接头序列。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQIDNO：15、4和16的抗原结合结构域。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含(i)SEQIDNO：7的CD8跨膜结构域和SEQIDNO：6的CD8铰链结构域，或(ii)SEQIDNO：11的CD28跨膜结构域和SEQIDNO：10的CD28铰链结构域。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的CAR，其中所述胞内T细胞信号传导结构域包含SEQIDNO：8的4-1BB胞内T细胞信号传导结构域，SEQIDNO：9的CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域，或上述两者。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的CAR，其中所述CAR还包含间隔子。


9.嵌合抗原受体(CAR)，其包含对CD33具有抗原特异性的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域，其中
(a)所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含hP67.6的CDR1、CDR2和CDR3区；和/或
(b)所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含hP67.6的CDR1、CDR2和CDR3区，
其中所述CDR区是SEQIDNOS：47-52中的CDR区。


10.根据权利要求9所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQIDNO：3的重链可变区。


11.根据权利要求9或10所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQIDNO：5的轻链可变区。


12.根据权利要求9-11中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦海瑛，特里·J·弗莱，
申请(专利权)人：美国卫生和人力服务部，
类型：发明
国别省市：美国;US